野外药用真菌的菌种分离和保藏.pdfVIP

第9卷 第6期 滁 州 学 院 学 报 Vo1．9 No．6 2007年 11月 J0URNAL OF CHUZHOU UNIVERSITY NOV．2OO7 野外药用真菌的菌种分离和保藏 殷培峰 浦冠勤 (滁州学院 化学与生命科学系，安徽 滁州239012；；苏州大学 城市科学学院，江苏 苏州 215006) 摘 要：对野生药用真菌的研究十分重要两个方面是菌种分离和菌种保藏。菌种分离常用方法有孢子分离、组 织分离和基质分离；分离后菌种常用的保藏方法有：室温保存，低温保存，矿物油保存，盐水保藏，孢子滤纸保 藏，自然基质保藏。 关键词：药用真菌；菌种分离；菌种保藏 中图分类号：$646 文献标识码：A 文章编号：1673—1794(2007)06—0068—04 作者简介：殷培峰(1979一)，男，山东临沂人，实验师，硕士，滁州学院化学与生命科学系。 在对野外药用真菌进行研究过程中，菌种分离、扩大培养十分重要。菌种分离是将目标真菌从混杂的微 生物中分离开来，分离过程中得到的菌丝体经纯化后，得纯菌种，然后在实验室条件下，使纯菌种大量生长和 繁殖，用于教学示范、试验研究或应用开发等各种目的。 1菌种的分离 药食用真菌菌种的分离通常采用孢子分离、组织分离和基质分离等方法。孢子分离法是利用成熟子实体 的有性孢子自动从子实体中弹射出来的特性，在无菌条件下接收，然后在适宜的培养基上使孢子萌发成菌 丝而获得纯菌种。组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法，也是一种最常用的方法。基质分 离法是利用存留在寄主基质内的菌丝体，在适宜的条件下使之重新恢复活性的过程。 1．1准备 菌种的分离培养应符合无菌操作的要求，才能使分离获得成功。接种的过程是分离和扩大各级菌种的过 程，实验前要准备好用于菌种生长的培养基，常用的是PDA培养基、蛋白胨培养基、酵母葡萄糖培养基、MS 培养基等不同氮源和碳源培养基，以满足菌丝生长需要。 各种实验设备，如超净工作台，各种分离和接种工具，在实验前灭菌消毒，恒温培养箱或恒温培养室等调 试准确。常用的消毒药品有乙醇和升汞等。超净工作台在分离前的1d或0．5d用福尔马林熏蒸，也可在工作 前1h用5％石炭酸喷雾，然后用30w紫外灯照射0．5h，关灯0．5h后工作【lJ。 1．2菌种的采集 1．2．1孢子的收集分离 对产孢子真菌分离时一般多采用孢子分离方法。在选择材料时，应从菌丝或子实体生长健壮、无病虫，且 在七、八分成熟的菌株上采集。分离时常用整菇插种法、三角瓶钩悬法等。 在用整菇插种法时，首先安装经过灭菌的孢子采集器，作为采集孢子的种菇切去菌柄，浸入无水乙醇中 lmin左右，然后浸入0．1％升汞中Imin(银耳、木耳类的子实体只能用无菌水洗涤数次【2】)，然后用无菌水冲 洗种菇表面的残留药液。用无菌纱布擦干表面水分，将菌盖插在孢子采集器的三角架上，盖上钟罩，然后在培 收稿日期：2007—07—28 — 68— 养皿周围放置用n1％升汞浸过的纱布，以增加罩内湿度，防止杂菌污染。最后用无菌纱布包好整个孢子采集器，放入2O ～25℃的恒温 箱中。收集1d后，取出盛有孢子的培养皿，然后进行分离接种培养。 另一种常用方法为三角瓶钩悬法，适用于不具菌柄的子实体孢子的采集。在无菌条件下将子实体用无 菌水洗涤，无菌布吸干，取一两头带钩的金属物，经火焰灭菌后一端钩住子实体，另一端钩在三角瓶上，加棉 塞，室温下放置1d左右，然后取出子实体，三角瓶内的孢子即可用于分离口1。 收集的孢子可通过单孢分离法和多孢分离法加以分离而获得纯菌种。单饱分离是将收集到的孢子通过 一 定方法，如稀释分离、平板划线分离、器械分离和毛细管法单个分开进行培养，对于蘑菇、草菇等同宗结合 的真菌来说，经双核化后，都具有结实能力，但另外一些毛木耳、金针菇、香菇、平菇等异宗结合类的真菌，单 个孢子萌发的菌丝无结实能力，必须通过不同性别孢子间的结合，才能结实[41。因此单孢分离主要用于研究 各类真菌的生物学特性和遗传特性。多孢分离是将许多孢子接种在同一培养基上，让其萌发后自由交配，然 后挑选典型的菌落转接，获得纯菌种，是孢子分离培养的常用方法。 1．2．2组