副猪嗜血杆菌PCR鉴定方法的建立.pdfVIP

副猪嗜血杆菌PCR鉴定 方法的建立 周勇岐 刘茂军’，苏国东 ，朱晓玮 ，丁美娟 ，邵国青’ (1．江苏省农业科学院兽医研究所 江苏 南京 210014；2．南京天邦生物科技有限公司 江苏 南京 211lo2) 摘 要：以HPS的16SrRNA~的基因序列设计合成引物，进行PcR扩增，标准菌株NR4、SW124、SWl 14、SWl40 和分离株xx、FS在预计的821 bp位置上扩增出特异性条带，NJING株、胸膜肺炎(APP)等没有特异性条带 产生。这证明PCR检测副猪嗜血杆菌具有较高的特异性和敏感性。 关键词：副猪嗜血杆菌；PCR 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起猪的多 染性胸膜肺炎放线菌XM9株等菌株分别接种于改良巧克力琼 发性浆膜炎，又称为革拉泽氏病(Glasser’S Disease)，临床表现 脂平板，37℃培养48 h。观察菌落形态，染色镜检，如有杂菌 以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜 污染要挑取单个菌落进行亚克隆接种培养，至菌落形态单 炎等为特征。 一 。 每个平板加入pH7．0的冲洗液，然后5 000 r／min离心 1 材料 5 min，弃上清再~j[IPBS液10 mL离心，如此重复3次，最后 1．1 菌株 沉淀加纯水20 mL，4℃备用。 副猪嗜血杆菌标准株NR4、SW124、SW140、SWI14北京 2．2 DNA模板的制备 市农林科学院畜牧兽医研究所惠赠。 将每个菌液样品分别取I．5 mLJJN入Effendorf管中，煮沸 疑似副猪嗜血杆菌国内分离株QDWF株、NJING株、XX 10 min，煮沸后，在15 800 r／min离,55 min，取上清液加入适量 株 XS株、PZ株、FS株、JUNQ株、NJJQ株、HNDY株、JAS1株。 EDTA缓冲液置4℃保存，作为PCR模板备用。 传染性胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌由江苏 2．3 PCR扩增 省农业科学院兽医研究所提供抗原培养物。 将2个PcR引物和15株待检菌株的模板DNA进行扩增， 1．2 PCR引物序列 PCR反应体系为：10 XPCR buffer 5 L，25mmolMg 2．5 L， 以HPS的16SrRNA中的基因序列设计引物，由上海生工 2．5mmol dNTPs 4 1，25 mol上游引物2．5 L，25 mol下游 生物工程有限公司合成，序列如下： 引物2．5 L，Taq酶0．5 L，ddH，O 30 L，模板DNA 3 L。 上游引物5、GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT3、，下 PCR反应条件为：95℃2 min，94℃30 S，50℃30 S，72℃ 游引物5、GGC TTC GTC ACC CTC TGT 3、。 1 min，35cycle，72℃6 min进行PCR反应。PCR产物在1％的琼 2 方法 脂糖凝胶上电泳，在紫外灯光下观察结果。 2．1 菌体培养 3 结果与讨论 将副猪嗜血杆菌标准株：NR4、SWl24 SW140、SW114， 3．1分离株的扩增 疑似副猪嗜血杆菌国内分离株：QDWF株、NJING株、XX株、 用上述10个分离株、1个胸膜肺炎放线杆菌株和4个HPS XS株、PZ株、FS株、JUNQ株、NJJQ株、HNDY株、JAS1株，传 标准株同时进行PCR扩增，标准株NR4、SW124、SW140、 SW1 14及分离株XX、FS在821bp的位置上扩增出特异性条带； 基金项目：本项目受江苏省科技成果转化专项资金(BA2004032) 分离株QDWF、NJING、XS、PZ、JUN