Irx5a对于斑马鱼早期造血发育转录调控因子的影响.pdfVIP

贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 Irx5a对于斑马鱼早期造血发育转录调控因子的影响 专业名称：儿科学， 研究生：李燕，导师：何志旭 教授 摘 要 目的：为了解 Irx5a基因对早期造血发育的影响，检测 Irx5a对野生型斑马鱼基 因表达量的变化；通过过表达Irx5a基因对造血发育表达相关的造血转录调控因 子的表达情况影响。 2+ 方法:构建 Irx5a-EGFP-pCS 重组质粒,验证其正确性后，制备 Irx5a-EGFP 正义 mRNA 探针,通过显微注射技术导入野生型斑马鱼（Tuebingen）中，观察其在野 生型斑马鱼胚胎中的表达情况。另外，以导入Irx5a-EGFP mRNA 探针为实验组、 EGFP mRNA 探针为实验对照组、野生型斑马鱼为空白对照组，应用实时荧光定量 PCR 反应检测造血转录调控因子如 scl、lmo2、c-myb、runx-1、gata-1、pu.1 在实验对照组及实验组及空白对照组中的表达水平。 2+ 结果：成功构建 Irx5a-EGFP-pCS 重组质粒；通过显微注射 Irx5a-EGFP mRNA 发 现，在斑马鱼胚胎3hpf 开始出现绿色荧光，在12hpf-18hpf 时荧光表达量最强， 其后荧光表达也逐渐减弱，至30hpf 时荧光几乎消失，仅在斑马鱼的眼睛有极少 量的表达；Irx5a-EGFP mRNA 作为实验组，EGFP mRNA 作为实验对照组，野生型 斑马鱼作为空白对照组，三组相比较基因表达量相对定量中可知：lmo2、scl、 runx-1、pu.1 实验组表达量较另两组表达量低，三组均随着时相的增加基因表 达量也增加，在12hpf 中的表达量最高，以后逐渐减弱；但是c-myb、gata-1、 中在18hpf 中的表达量最高，以后逐渐减弱。 结论：在野生型斑马鱼 Irx5a 基因于 3hpf 开始表达，多集中于神经系统，于 12-18hpf 表达量较高，以后逐渐减弱。在实时荧光定量 PCR 实验结果中推测： 在过表达 Irx5a mRNA 斑马鱼胚胎造血发育中，造血转录调控因子中是发挥着下 调作用的，由此可知，Irx5a基因在斑马鱼原始造血、成体造血、红系、髓系重 要的转录调控因子是发挥着抑制作用的。 关键词：斑马鱼、Irx5a、造血发育转录调控因子 本研究受：国家自然科学基金面上项目 ） 2 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 前 言 [1] 造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs） 具有高度自我更新能力 和多向分化潜能，HSC 的自我更新是由促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调 控信号之间的平衡来实现调控的。HSC 以不对称的分裂方式由一个细胞分裂为两 个细胞，其中一个细胞仍保持干细胞的一切生物特性来维持体内干细胞数量的相 对稳定，这就是干细胞的自我更新；而另一个细胞则进一步增殖分化为祖细胞、 各类成熟血细胞，释放到外周血中发挥各自功能，直至细胞衰老死亡，这一过程 即干细胞的多向分化潜能。 此外，造血干细胞还具有静止性和异质性的生物学 特性。造血干细胞在发育的过程中其不同的阶段及各系中有其特异的造血转录调 控因子，如：原始造血 lmo2、scl；成体造血 c-myb、runx-1；红系造血gata-1； [2] 髓系造血 pu.1 。 伊洛魁 同源盒基因家族属于脊椎动物中 TALE （three amino acid loop [3] extension）类同源盒转录因子中的成员 。伊洛魁基因首次是在果蝇中发现的， 有三个紧密相连的基因簇，即 Araucan、Caupolicanand、Mirror[3,4] 。Irx 基因 编码具有高度保守的源结构域 TALE 超家族，36 个氨基酸 TALE 同源盒家