KCa3.1在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌 细胞钙化的机制研究.pdfVIP

中 文 摘 要 KCa3.1 在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉 平滑肌细胞钙化的机制研究 摘 要 目的：心血管疾病( Cardiovascular disease ，CVD) 是慢性肾脏病 ( Chronic kidney disease，CKD ）患者最常见的并发症，也是导致终末期 肾病( End stage renal disease，ESRD) 患者死亡的首要原因。血管平滑肌 细胞（Vascular smooth muscle cells ，VSMCs ）向成骨样或成软骨样细胞 转化从而导致的动脉血管钙化是发生心血管事件的关键步骤。ESRD 患者 在透析过程中使用碳酸氢盐透析液，使机体短暂的处于碱性环境。有研 究发现，腹腔注射碳酸氢钠的大鼠血管钙化更加严重，但碱性环境促进 血管钙化的机制并不清楚。中电导钙激活钾离子通道（Intermediate- conductance Ca2+-activated K+ channels, KCa3.1 ）是依赖钙激活的重要的钾 离子通道，在平滑肌细胞中广泛表达，参与多种细胞调节功能，与高血 压、动脉粥样硬化密切相关，因此我们推测其可能在血管钙化中着重要 作用。探究KCa3.1 在血管钙化的作用，为临床治疗提供新靶点。 方法： 1 选择4 周龄健康雄性SD 大鼠80g-100g，通过组织贴壁法进行平滑 肌细胞原代培养；选择6 周龄健康雄性SD 大鼠200g-250g ，进行体外血 管环培养。SD 大鼠购自河北医科大学动物实验中心。 2 体外血管平滑肌细胞培养：采用组织块贴壁法培养原代大鼠主动 脉平滑肌细胞，使用 10mmol/L β-甘油磷酸制备血管平滑肌细胞钙化模 型。使用10mmol/l HCl 和10mmol/l NaHCO 调整培养基pH 值。采用随 3 机数字表法，将血管平滑肌细胞随机分为6 组：正常pH7.4 组、高磷pH7.4 组、高磷pH7.7 组、高磷pH8.0 组、正常pH8.0 组、TRAM-34 干预组（在 高磷pH8.0 组培养基基础上加入20nmol/L TRAM-34 ）。 体外血管环培养：将 6 周龄 SD 雄性大鼠麻醉后，无菌条件下取出 胸主动脉，小心剥掉外膜、内膜后，将血管制成 2mm-3 mm 长的血管环， 分别置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，调整pH 值方法、血管环 分组及各组培养基情况同体外细胞培养。 1 万方数据 中 文 摘 要 3 茜素红染色法和邻甲酚酞络合酮比色法判断细胞钙化程度；von Kossa 染色法和邻甲酚酞络合酮比色法判断血管环钙化程度。荧光探针法 测定血管平滑肌细胞内钙离子浓度。RT-PCR 、Western Blot 检测各组细胞 中KCa3.1 和调节成骨和软骨分化的关键转录因子Runx2 表达，酶联免疫 吸附法测定碱性磷酸酶（ALP ）活性。免疫组织化学法检测各组血管环 中KCa3.1 、Runx2 表达。 4 数据分析采用 SPSS17.0 软件分析，符合正态分布的计量资料以 ( x  s )表示，两组间均数比较采用t 检验，多组间均数比较采用单因素方 差分析，组间两两比较用S-N-K 检验（Student-Newman-Keuls ，SNK）， 相关分析符合双变量正态分布作 Pearson 积差相关分析。P0.05 为差异 有显著性。 结果： 1 碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化和血管环钙化的影响 1.1 碱性环境对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响：细胞培养 1