骨髓间充质干细胞治疗视网膜疾病实验进展.docVIP

骨髓间充质干细胞治疗视网膜疾病实验进展各种视网膜疾病，如视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑病变(AMD)等，视网膜光感受器的损伤可导致不可逆的视力丧失。对于此类疾病，人们尝试了很多方法来修复视网膜细胞变性，阻止视网膜光感受器的丧失，其中包括营养支持治疗、基因治疗、神经生长因子、以及人工眼等。然而，这些方法都未能取得确切的临床疗效，因此人们开始转向寻找合适的细胞源作为移植物，通过视网膜的细胞移植来代替丢失的细胞或者起到支持细胞的作用，以阻止更进一步的细胞丢失 随着干细胞应用技术不断突破，为我们最终有效的治疗这些眼病，恢复患者的视功能提供了一个良好的契机。再加上眼睛的解剖结构明确，并具有透明的屈光介质、便于操作定位及观察的特点，使得与其他神经系统疾病相比，视网膜疾病在细胞移植方面发展得更为迅速 1 间充质干细胞具有优势 干细胞是生物个体生长发育中具有自我更新、增殖和多向分化潜能的细胞群体，分为胚胎干细胞和成体干细胞。目前研究较多用于视网膜移植的干细胞包括胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞中的间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)、神经干细胞(NSC)和视网膜干细胞/祖细胞(RPC)等。但由于MSCs易于获得，且无胚胎干细胞或神经干细胞的伦理障碍，同时也避免了异体移植的免疫排斥反应，在目前临床前试验和临床应用中尚未见致畸作用的发生。因此，MSCs在干细胞移植方面具有优势，也是目前研究相对深入的一群具有多向分化潜能的成体干细胞 然而，要想实现MSCs的临床应用，就必须克服MSCs的选择、培养扩增、体外标记、植入体内及植入后的融合等一系列技术难题。目前，MSCs移植主要以大鼠骨髓间充质干细胞实验对象，已进入动物实验的阶段，虽取得了一些突破，但同时也存在不少难题。现从大鼠骨髓间充质干细胞分离培养研究近况和大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞的研究近况二方面进行综述 2 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养研究近况 间充质干细胞广泛分布于人体各种器官和组织，但最易得到、最富集和研究最多的是来源于骨髓。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞。在XX年代初人们通过骨髓培养发现，它是中胚层发育的早期细胞，可以分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞等。由于其多分化潜能和强大的自我更新能力，使BMSC可以作为种子细胞用于组织工程和基因治疗的研究 3 获取含BMSCs的骨髓 据研究，BMSCs在骨髓中的浓度不高，约占有核细胞的0.001%～0.01%，要想成功获取高质量的BMSC需要在选择大鼠并用适当的方式去获取BMSCs的骨髓液 3.1 不同周龄大鼠骨髓MSCs的分离效果不同 大部分文献报道是以周龄作为选择大鼠的指标。Zhang等认为骨髓MSCs的增殖能力与动物年龄有关，随着年龄增加，成纤维细胞集落形成单位(CFU-F )测定显示骨髓克隆形成细胞的数量逐渐递减。谢茂松等研究发现，在相同接种密度条件下，观察到1 mo龄鼠的增殖能力较2mo和4 mo龄鼠强，2mo龄鼠的增殖能力较4mo龄鼠强。晏丹等对1mo到2mo龄鼠作了进一步的分析，结果发现：4周龄大鼠下肢骨分离所得的细胞数较少，原代培养长出的细胞克隆少，很难汇合成片；8周龄大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞，密度梯度离心后，在白膜层形成颗粒状聚集物，影响后续的分离与培养效果；6周龄的大鼠在细胞分离的质和量上达最佳效果。故晏丹等主张选择6周龄的大鼠作为实验动物 3.2 不同体重大鼠骨髓MSCs的分离效果不同 也有文献报道是以体重作为选择大鼠的指标。Zhang等[1]认为动物体重对骨髓MSCs的分离有影响：体重≥250g的大鼠骨髓中含有较多的脂肪细胞，密度梯度离心后，在白膜层形成颗粒状聚集物，影响分离效果；体重150g的大鼠骨骼细小，分离所得的细胞数少。Zhang等认为，150~250g左右的大鼠在骨髓MSCs分离的质和量上可达到较佳效果 3.3 获得含BMSC骨髓液的方法 3.3.1冲洗法 骨髓冲洗法的剪断股骨、胫骨的方法有二种，即干骺端和骨干中间剪断法二种。谢茂松等[2] 研究发现，剪去干骺端法和骨干间剪断法在细胞纯度差异无统计学意义，但获取的MMSC细胞上，剪去干骺端法比骨干间剪断法数量少，这可能与BMSCs主要在干骺端有关 3.3.2夹碎震荡法 余劲明等用将大鼠的股骨、胫骨完全剥离，清除肌肉组织后，直接用止血钳将骨完全夹碎，尤其是干骺端，后充分暴露骨髓腔，通过震荡尽可能使造血干细胞置于缓冲液中。再用筛网过滤去除碎骨，离心后获取细胞。改良操作后，与传统的冲洗法相比，操作时间缩短，获取的P0细胞