骨髓增殖性肿瘤JAK2V617F基因突变的临床意义.pdfVIP

ChinJLabDiagn，May，2012，Vol16，No．5 文章编号 ：1007—4287(2012)05--0912—02 骨髓增殖性肿瘤 JAK2V617F基因突变的临床意义 魏佳慧，谭 平 ，何成彦，徐雪松 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033) 蛋白质酪氨酸激酶是信号通路中的重要调控因 rain，94。C变性 2Os，61℃退火 2Os，72C延伸 30S， 子 ，也是重要的治疗靶标_l1]。2005年 ，5个研究小组 共计 35个循环 。 ‘ 同时发 现在 费城染色体 阴性骨髓增殖性肿 瘤 首轮 PCR产物稀释 10倍 ，取 1 l作为ASP的 (MPN)，即真性红细胞增多症 (PV)、原发性血小板 模板 ，ASP所用常规引物为 P2：CCTCAGAACGT— 增多症 (ET)及原发性骨髓纤维化 (PMF)患者体 内 TGATGGCA 和 P2r：ATTGCTTTCCTTTTTCA— 存在 JAK2V617F突变[2]。JAK2V617F突变体的 CAAGA；特异性引物为 Pnf：AGCATTTGGTTT— 酪氨酸激酶活性显著升高，并能在转基因小鼠和骨 TAAATTATGGAGTATATG 及 Pmr：GTTT— 髓移植小 鼠模 型 中引起类似人 MPN 的表型口 ]。 TACTTACTCTCGTCTCCACA AA 随后我们又发现在非 MPN人群 中，JAK2V617F的 A。ASP使用 TaqDNA 聚合酶 ，反应条件为 94℃ 突变率约为 1 ，这远远高于 MPN 的发病率 ]。本 预变性 1min，94。C变性 20S，60。C退火30S，72℃延 研究应用等位基因特异性 PCR技术 ，检测 MPN病 伸 30S，共计 3O个循环 。 例中JAK2V617F的突变情况 ，以探讨 JAK2V617F 1．3．2 琼脂糖凝胶电泳 配制 3 的琼脂糖凝胶 ， 基 因突变在 MPN临床诊断中的意义。 取 ASP产物 3 l与适量 LoadingBuffer混匀，上 1 材料与方法 样 ，11OV 电泳 30rain后 ，用凝胶成像系统分析图 1．1 标本来源 2007年 9月一2010年 6月吉林大 像。出现 279 bp 产 物 的样 本 即可 确 定 为 学中日联谊医院临床诊断 MPN 患者 116例 ，其 中 JAK2V617F阳性 。 男 65例 ，女 51例。按照 2005年 WHO诊断标准 ： 1．3．3 序列分析 首轮 PCR产物经凝胶 回收、纯 PV56例 ；ET45例；PMF15例。收集以上患者外 化后 ，由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。 周血，使用全血基因组 DNA提取试剂盒提取基 因 2 结果 组 DNA。 2．1 ASP和测序分析 1．2 主要试剂 ①全血基因组 DNA提取试剂盒 应用 ASP方法 ，我们检测 了 116例确诊 MPN 购于鼎 国生物技 术 公 司。② PCR反 应试 剂 ：Taq 患者样 本 JAK2V617F 的突变 情 况。引物 P2和 DNA聚合酶为 TaKaRa产品，dNTP购于 Invitro— P2r产物大小为 453bp，结果 中出现该片段说 明 gen公司，本文所用引物均 由 Invitrogen公司合成。 PCR正常；引物P2和Pmr的产物为突变产物，大小 ③琼脂糖购于 Biowest公司。④DNA凝胶 回收试 为 279bp，只要 出现 该 产 物 即可 判 断 样 本 为 剂盒购 自OMEGA公司。 JAK2V617F阳性 ；引物 Pnf和 P2r的产物为非突变