乙肝病毒hbx基因稳转细胞系的建立及其诱导的内质网 - scholarmate.pdf

安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Mar；49(3) ·283 · ◇基础医学研究◇ 乙肝病毒 HBx基因稳转细胞系的建立及其诱导的内质网应激 陆 鹏 ，姜同翠 ，陈 露 ，沈玉君 ，沈玉先 ，方圣云 摘要 目的 建立乙肝病毒(HBV)HBx基因稳转细胞系，并 到广泛关注，但关于HBV病毒 HBx蛋白的过度表 观察该细胞系的增殖活性及内质 网应激相关基因的表达情 达在肝癌的发生发展中的作用，目前仍不清楚。该 况。方法 采用 RT．PCR法从 HepG2．2．15细胞株 中克隆 实验通过克隆HBx基因并建立稳定表达HBx蛋白 HBx基因编码 区片段，构建 pcDNA3．I-HBx真核表达质粒。 的肝癌细胞系，观察 HBx的过度表达是否可引起 利用脂质体将pcDNA3．1-HBx转染至人HepG2细胞系，通过 ER应激及对肝癌细胞增殖活性的影响，为后续相关 G418筛选后 ，经Westernblot法对 HBx的表达进行验证。并 机制研究提供参考。 用MTr法检测细胞的增殖活性，同时观察过表达HBx蛋白对 内质网应激相关基因表达的影响。结果 成功构建了HBx 1 材料与方法 的真核表达质粒；建立了HBVHBx基因稳转细胞系；MTY法 检测显示该细胞系增殖活性明显上升；同时也发现HBx基因 1．1 材料 的过表达可上调 内质网应激相关基 因BiP、PERK、ATF6、 1．1．1 细胞株、茵株及质粒 人肝癌细胞株HepG2 XBP1、MANF的表达，而CHOP的表达降低。结论 HBx基因 购 自中国科学院上海细胞库；表达HBV全基因组的 过表达可诱导内质网应激 ，并促进HepG2细胞增殖。 肝癌细胞株 HepG2．2．15为沈继龙教授惠赠；菌株 关键词 HBx；细胞增殖 ；内质网应激 E．coliDH5ot为本实验室保存 ；质粒pcDNA3．1Vec- 中图分类号 R34 tor为美国马里兰大学方圣云教授惠赠；真核表达重 文献标志码 A 文章编号 1000—1492(2014)03—0283—05 组质粒pcDNA3．1一HBx由本实验室构建。 1．1．2 主要试剂 DMEM培养基、opti．MEM购 自 乙肝病毒 (hepatitisBvirus，HBV)感染引起的 美国Gibco公司；胎牛血清购 自杭州四季青公司；胶 慢性乙型肝炎被普遍认为是导致肝癌发生的重要因 回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购 自美国Axygen 素。据统计，我国半数以上的肝癌患者有慢性乙肝 公司；质粒大量提取试剂盒购 自北京康为世纪生物 病史。研究 显示亚洲和北美地区乙肝抗原阳性 科技有限公司；G418购 自上海生工生物工程有限公 携带者罹患肝癌的比例是非感染人群的25～37倍。 司；脂质体 Lipofeetamine2000购 自美 国Invitrogen HBV是嗜肝 DNA病毒家族的溶原性病毒，基因组 公司；DNA连接酶、ExTaq和各种限制性内切酶购 呈双链环状结构，含有 4个开放读码框架，分别为 自日本TaKaRa公司；其他试剂均为国产或进 口分 s、P、c、x区，其 中x区所编码 的产物 HBx蛋 白