中药调控骨重建偶连中IGF－1的表达.pdfVIP

中医正骨2008年 11月第20卷第 11期 (总825) ·ll · 中药调控骨重建偶连 中IGF1的表达 青岛市骨伤科医~(266021) 史风雷 王海彬 主题词 骨重建腐 物作用 生脉成骨片腐 效学 IGF-1 存备用。将在灌胃后 1小时采血的血清用DMEM配成 10％含 血清药理学 实验研究 药血清溶液，进行细胞培养。 IGF-1是骨内含量最丰富的一类细胞因子，它通过 自分泌 1．7 细胞外液 IGF-I的测定 采用大鼠IGF-I放射免疫检测 与旁分泌的方式 ，刺激成骨细胞的复制和骨基质的合成。我 试剂盒 (DiagnosticSystemsLaboratory，ineUSA)测定。 们建立了成骨细胞与破骨细胞共育偶连体系，模仿人体的骨 1．8 共育系中细胞 IGF-ImRNA(RT-PCR)表达的测定 采用 重建环境 ，观察中药对骨重建偶连中IGF-1表达的影响。 一 步法PF-PCR试剂盒(晶美公司)测定，引物序列为：IGF-I上 1 材料与方法 游引物 (5—3)：眦 TGGAGGC1ETIEAGFTC。下游引物 (5． 1．1 成骨细胞与破骨细胞共育偶连体系的建立 先分别分 3)：GCAGGTGrITCCGATGTrrTG(扩赠片段400bp)。8-aetin 离培养成骨细胞与破骨细胞，使用24孔板 ，对生长于盖破片 上游引物 (5．3)：TICCAGCCFTCCTGG。下游引物(5．3)：TFG 上破骨细胞进行细胞计数，然后消化已成为单层的成骨细胞 ， CGCTCAGGAGGAGCAAT(扩赠片段225bp)。 并计数 ，用培养液调整成骨细胞数 ，使成骨细胞和破骨细胞达 1．9 PCR产物电泳 取各PCR产物 10出、分子量标准参照物 到 100：1比例，种植成骨细胞于 24孔板中，细胞用含有 1mM (mark~)10 ，加载样缓冲液2 在0．5×TBE电泳缓冲液(含 的B．甘油磷酸钠培养 6小时后，取已经培养成功的破骨细胞 溴化乙锭O．5 ·IIll )中，经 1．5％琼脂糖凝胶 (含溴化乙锭 和成骨细胞进行贴面培养 ，贴面培养的方法是在培养板中放 0．5ggm·l )电泳，电压4V·cm～，电泳时间2小时。 置毛细玻璃管，用带有破骨细胞 的盖玻片面向下与成骨细胞 1．10 光密度扫描及计算 紫外检测仪下用 kodak胶卷摄片， 接触培养。细胞用含有 1mM的 甘油磷酸钠培养 6小时后 ， kodak凝胶扫描系统 ，用 图像扫描仪对底片进行灰度扫描 ，凝 更换为2％含有 1，25(OH)2 10 mol·LI1和 100nM的含地塞 胶电泳分析软件(kodak公司kodakditalscienec1D软件)分析 米松的小牛血清培养液，孵育 48小时，用于实验。每板为 1 测定其光密度 ，各电泳条带净密度按下列公式计算：净密度值 组，分别加入含药血清和空白血清的培养液，培养 l0天后进 = (平均密度一背景密度)X面积。以同管所扩 aelil1密度作 行检测。 为内参照，以目标基因净密度与 枷 n净密度的比值进行半 1．2 实验药物 生脉成骨片浸膏(由广州中医药大学新药开 定量 比较 。 发中心提供)。 1．11 统计学处理 均数以牙±s表示。组间均数 比较采用 t 检验，显著性水平设 a：0．05。 1．3 实验动物 选用清洁级大 鼠3o只(雌性 ，体重200±10 采用 STSS10．0统计软件处理。 g)，用苦味酸编号后随机分为A、B两组，每组 15只。两组大 鼠自由进食饲养 ，分别给予2种液体灌 胃。 2 结 果 1．4 灌胃方法