荧光定量PCR／熔解曲线分析法快速鉴定葡萄球菌菌种.pdfVIP

实用医学杂志 2008年第 24卷第 21期 荧光定量 PCR／熔解 曲线分析法快速鉴定葡萄球菌菌种 蓝文莉 龙 军 钟 慧 彭永正 江凌晓 摘 要 目的：建立一种基于葡萄球菌 16～23srRNA间隔区序列特征的荧光定量PCR／熔解曲线分析鉴定 方法，以快速鉴定葡萄球菌菌种。方法：在葡萄球菌 16SrRNA3端和23srRNA5端分别设计上、下游引物。用荧 光定量PCR方法扩增各个实验菌株的 16～23srRNA间隔区序列。然后分析各扩增产物的熔解曲线，以确定各个 茵种熔解曲线特征．并以此为依据对 15株葡萄球菌临床分离株进行鉴定。结果：设计的引物对成功地扩增 了葡萄 球菌所有实验菌株，对扩增产物的熔解曲线分析可初步鉴定金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球茵。以 VITEK2鉴定结果为标准， 荧光定量PCR／熔解曲线分析法鉴定菌种的准确率为67％(10／15)，整个实验可在 lh 内完成。结论：荧光定量PCR／熔解曲线分析法有望成为临床实验室快速鉴定葡萄球菌茵种的新方法。 关键词 葡萄球菌属 rRNA间隔区 熔解曲线分析 葡萄球菌是人类主要病原菌之一，1974年，Bergey 和 23srRNA基 因序列 的保守性 ，采用 Primer 细菌学鉴定手册(第8版)[-]将葡萄球菌分为金黄色葡 premier5．0引物设计软件设计扩增引物 ．引物序列如 萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌3种，随着微生 下 ：Pl，5一GTCGTAACAAGGTAGCCGTATCG一3 ，P2， 物学的飞速发展 。在第 9版 (1994)~杰鉴定细菌手册 5．TCCCCATrCGGAAATCTCTG一3。引物 由宝生物工 中，葡萄球菌属被分为32个种、l5个亚种[z-。虽然葡萄 程 (大连)有限公司合成。 球菌菌种多达 32种，但在葡萄球菌的临床感染中， 1．2 方法 90％以上是由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血 1．2．1 模板 DNA制备 采用快速煮沸法制作模板 葡萄球菌感染引起的。因此，快速鉴定出金黄色葡萄球 DNAI 。 菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌具有重要临床意义。 1．2．2 PCR扩增／熔解曲线分析 扩增总体积为 2O 本研究 目的是建立一种基于葡萄球菌 16 23SrRNA L，包含 lO LSYBRGreenPremixEx TM(2x)，0．4 间隔区序列特征的荧光定量PCR／熔解 曲线分析方法 ， L上游 引物 (10I~mol／L)，0．4trL下游 引物 (10 以快速准确鉴定葡萄球菌菌种。 p,mol／L)，2 模版DNA，7．2 无菌双蒸水。扩增参 1 材料与方法 数为：(1)预变性：95oC10s20~C／s。(2)PCR反应：95qC 1．1 材料 5s20oC／s，62oC40s20／s，共4O个循环。(3)熔解曲 1．1．1 实验菌株 选取 2007年 1—6月珠江医院检验 线分析 ：95℃0S20oC／s，65oC15S20℃／s．95℃0s 科微生物室保存的葡萄球菌临床分离株 39株，其中 0．05℃／s。(4)冷却 ：40oC0s20oC／s。根据退火延伸温 金黄色葡萄球菌 15株 ，表皮葡萄球菌 11株 ，溶血型 度和时间不同有 3个扩增条件。每次实验均包括空白 葡萄球菌4株 ，人型葡萄球菌 2株 ，头状葡萄球菌 l 对照 (模板 DNA由无菌双蒸水代替)。实验数据用 株，科氏葡萄球菌 2株，木糖葡萄球菌 1株 ，耳葡萄球 SPSS统计软件进行分析。 菌 1株．松鼠葡萄球菌 1株 ，路邓葡萄球菌 1株。上述 1．2．3 模板浓度影响评价实验 通过系列稀释法来 菌株全部经VITEK2鉴定系统鉴定。实验参考菌株为 评价模板浓度对荧光定量 PCR／熔解曲线分析鉴定方 金黄色葡 萄球 菌 ATCC29213、金黄 色葡 萄球 菌 法的影响。实验主要过程如下：任意挑