pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体构建及鉴定.doc

pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体构建及鉴定[摘要] 目的 构建带有报告基因EGFP的hIL-10真核表达载体。方法 通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因,构建IL-10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定,紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP-hIL-10载体序列正确。结论 成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。 [关键词] 基因;IL-10基因;真核表达载体;载体构建 [中图分类号] Q754[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)34-01-03 Construction and Identification of pIRES2-EGFP-hIL-10 Plasmid CHEN Lihong1LIU Jingfeng2FANG Hangrong1QIU Minglian2 1.Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;2.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China [Abstract] Objective To construct the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid of human. Methods IL-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using RT-PCR,and then pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was constructed. The identification was done by using endonuclease cutting,PCR and sequencing and the plasmid concentration and purity were detected by using UV spectrophotometer. Results Endonuclease cutting. PCR andsequencing showed the successful construction of pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid.Conclusion We construct pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid successfully and lay the foundation for immunotolerance researchesin the organ transplantation. [Key words] Gene;IL-10 gene;Eukaryotic expression vector;Vector construction 白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)是最初由Mosman等1989年发现的一种由Th2分泌的细胞因子,它能抑制Thl细胞因子的分泌。近来,越来越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性细胞的激活和细胞因子产生的作用,与移植物排斥有密切关系,因此在器官移植领域,越来越多的研究表明,IL-10能通过多种途径来抑制或减轻排斥反应,从而延长移植物的存活时间。我们通过构建hIL-10真核表达载体为今后在器官移植免疫耐受的进一步实验研究提供依据。 1材料与方法 1.1外周血单核细胞的制备 取正常人新鲜抗凝血5mL与Hanks液等量混匀后,加于4mL淋巴细胞分离液上,离心收集细胞,用5mL含10%的胎牛血清1640CM培养液悬浮,加入25mg/L的ConA,于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h。 1.2RT-PCR扩增人IL-10基因 淋巴细胞经ConA刺激后,用Trizol试剂按说明书提取总RNA。逆转录体系为:模板RNA溶液5μL,5×RT buffer 4μL,dNTP(各10mmol/L) 混合物2μL,RNA酶抑制剂0.5μL,引物设计参照GenBank上人IL-10基因序列分别设计引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAG CCACC ATGCACAGC TCAGCACTGCTCT,下游引物:IL-10R:CCGGAATTC TCAGTTT CGTATCTTCATTGTC。Oligo(dT)