HPLC法测定活络消肿搽剂中人参皂苷Rg1.doc

HPLC法测定活络消肿搽剂中人参皂苷Rg1【摘要】目的：建立活络消肿搽剂中主药三七的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定三七中的人参皂苷Rg1，以水-乙腈梯度洗脱，在203nm波长下进行测定。结果：人参皂苷Rg1的线性范围为0.17mg/ml～1.7mg/ml，平均回收率在97.9%，线性方程：A=1534.9×C＋1.6657r=0.9999。结论：该方法操作简便、准确、重现性好，有利于提高活络消肿搽剂的质量控制水平。 【关键词】活络消肿搽剂；三七；人参皂苷Rg1；高效液相色谱法 1概述 活络消肿搽剂是利用云南特有及在民间常用的三七、草乌、金铁锁和重楼等四味主药药材加适量辅料制成的搽剂，是肿瘤医院院骨科经过多年的临床经验，开发一种应用于跌打损伤、关节肿痛等使用方便的一种外用搽剂，以期通过临床的验证后申请医院制剂。该制剂具有散瘀活血，消肿止痛之功效。为了对该制剂的直来那个进行有效的控制，在开发过程中选择君药三七中的人参皂苷Rg1进行对该产品的质量控制研究。 2仪器、试剂与试药 2.1仪器：BP221型电子天平北京赛多利斯电子天平有限公司；Agilent1100型高效液相色谱仪美国安捷伦公司；ShimadzuLC－10Atvp型高效液相色谱仪日本岛津公司；AgilentC18、DiamonsilC18十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（250×4.6mm，5μm）； 2.2试剂与试药：人参皂苷Rg1对照品（0703-200221）中国药品生物制品检验所提供；三七总皂苷对照品（060807）中国药科大学分析测试中心标定；D101型大孔树脂（200目）河北沧州宝恩化工有限公司提供；三氧化二铝（200目）上海五四化学试剂有限公司提供； 2.3供试品：活络消肿搽剂（规格：50ml200911242009122920100213院制剂室试制； 乙腈均为色谱纯（美国Fisher公司），其余试剂均为分析纯。所用玻璃量具均已校正合格。 3检测条件及方法的确立 对活络消肿搽剂处方中几味药材进行分析，三七主要含三七总皂苷，草乌主要含生物碱、金铁锁主要含五环三萜类皂苷，重楼主要含薯蓣皂苷、重楼皂苷I和II。几味药材中三七和重楼具有成熟的高效液相测定法进行含量控制；鉴于三七是君药，而且为云南道地药材，对其研究比较多，对其成分也比较清楚，所以选择人参皂苷Rg1代表作为含量测定的控制指标。 检测波长的选择 参考《中国药典》2005年版中三七的检测方法选择的吸收波长203nm处测定三七中的人参皂苷Rg1。 前处理方法研究 原类似的中药制剂由于成分比较复杂，多采用于薄层扫描测定含量，很难准确定量地测定其中的目标成分的含量。经试验表明，供试品中含有糖类物质、皂苷和生物碱，通过大孔树脂处理能有效除去糖类物质，通通过三氧化铝处理能有效除去生物碱类和大量带有颜色的其他杂质。通过处理供试品可以直接用于高效液相分析。该前处理方法能有效消除干扰人参皂苷Rg1测定的物质，减小对色谱柱的影响。 色谱条件与系统适用性试验 参考《中国药典》2005年版中三七的检测方法采用C18色谱柱，在反相色谱体系中，选取水－乙腈作为流动相梯度洗脱（表1），流速为每分钟1.0ml，能有效分离大部分三七中所含物质，特别是Rg1与R1能完全分离，满足试验要求，色谱峰在60min内被完全记录，同时无干扰，符合药典规定。 表1：流动相梯度洗脱比例 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品，加70%乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。 供试品溶液的制备 精密量取本品5ml，蒸至近干，加水5ml加热使溶解，放冷，通过101型大孔吸附树脂柱（用水湿法装柱，内径1.2cm，长12cm），用水50ml洗脱，弃去水洗脱液，再用70%乙醇150ml洗脱，收集洗脱液，通过中性氧化铝（3g，200~300目，干法装柱，内径1.2cm），收集流出液，用70%乙醇50ml洗脱，合并洗脱液和流出液，蒸干，残渣加70%乙醇微热使溶解，并转移至10ml量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 测定法 取上述两种溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。 4检测方法的方法学验证 4.1准确度的考察（采用加样回收率测定法） 储备液的配制 精密称定人参皂苷Rg1对照品，加入70%乙醇配制成每毫升含0.3mg对照品储备液A。 供试品溶液的制备 取供试品适量，分别精密量取2ml本品共12份，任取3份，分别精密加入4ml储备液A；另取3份，分别精密加入5ml储备液