柱形藻酸钙载体制备及复合兔膝关节软骨细胞的初步观察.doc

　　柱形藻酸钙载体制备及复合兔膝关节软骨细胞的初步观察 ：刘松波　胡蕴玉　徐虎　吕荣　徐建强 【关键词】 钙 　　关键词: 钙;藻酸盐;软骨细胞;组织工程 　　摘 要:目的 构建用于软骨组织工程研究的新型细胞载体. 方法 通过向一定浓度的藻酸钠中加入二价阳离子并置入特殊模具中，经冷冻、脱水等处理，获得圆柱形藻酸钙载体，并复合软骨细胞观察. 结果 制备的藻酸钙载体具有网眼状结构，孔隙为60～160μm，嵴上并可见10～20μm的小洞.复合细胞组可见网眼中有数目不等的软骨细胞. 结论 柱形藻酸钙载体初步具备作为软骨细胞载体的条件，可用于软骨组织工程的研究. 　　Key;alginates;chondrocytes;tissue engi-neering 　　Abstract:AIM To fabricate a neer scaffold for the research on tissue engineering.METHODS Calcium algi-nate column alginate and calcium gluconate.The column structure of SEM ined.Construct of the column and chondrocytes ined by toluidine blue stain-ing and SEM.RESULTS The calcium alginate column shoesh structure aller holes in the ber of chondrocytes could be seen among the s.CON┐CLUSION As a material for chondrocyte scaffold，the calci-um alginate column might be employed in the research on car-tilage tissue engineering. 　　 0 引言 　　关节软骨损伤后有限的自身修复能力使其成为骨科基础及临床研究中的难点课题，至今尚未得到很好的解决.组织工程学为关节软骨的修复提供了崭新的方法.目前应用于组织工程研究的基质材料已有多种，但距临床应用仍有一定距离.我们应用海藻酸钠结合二价阳离子制备成具有一定形状的藻酸钙载体并复合软骨细胞，通过组织切片及扫描电镜观察，探讨其作为组织工程载体材料的可能性. 　　1 材料和方法 　　1.1 试剂和仪器 小牛血清（杭州四季青生物制品公司），胰蛋白酶（华美生物工程公司，西安），Ⅱ型胶原酶（Gibco公司），DMEM高糖培养基（Gibco公司），海藻酸钠粉剂（Fluka公司），葡萄糖酸钙（无锡第七制药厂）. 　　1.2 柱形藻酸钙载体的制备 将10g L-1 海藻酸钠与50g L-1 葡萄糖酸钙按5 1混合，在漩涡振荡器上充分混匀，使成半流动的糊状，即刻置入直径5mm，深度8mm的特殊柱形模具中，每孔容积约0.2mL，放-20℃冰箱过夜，次日取出解冻后，经系列乙醇溶液脱水及定形，最后放入750mL L-1 乙醇溶液中消毒备用.取样本冻干行扫描电镜观察. 　　1.3 软骨细胞的消化分离与收集 取3周龄新西兰白兔1只，雌雄不限，无菌切取双膝关节软骨并剪成约0.5mm碎片，置10mL离心管中，以含抗生素盐水冲洗，离心后2.5g L-1 胰蛋白酶消化30min，盐水洗2次，2g L -1 胶原酶洗1次，继而以之消化90min，吸取上清，800r min-1 离心10min，收集细胞于10mL离心管中，加入含200mL L-1 小牛血清DMEM培养基0.5mL.残余软骨粒继续以胶原酶消化，90min收集1次，共可收集4次，其后处理步骤同上. 　　1.4 载体与软骨细胞的复合 取制备好的藻酸钙载体4枚，复合细胞前用含200mL L-1 小牛血清的DMEM培养基冲洗浸泡.以无菌纱布轻压吸干其内的DMEM后加入上离心管中，应用毛细吸管将细胞混悬液滴于载体上，共同置37℃，含50mL L-1 CO2 孵箱中2h. 　　1.5 组织学及扫描电镜观察 将制备的藻酸钙载体及其与软骨细胞的复合体行30μm厚冰冻切片，甲苯胺蓝染色观察细胞与载体复合情况，同时另取标本观察扫描电镜. 　　2 结果 　　2.1 消化分离的软骨细胞计数及活力测定 消化分离的软骨细胞数目可达50×109 L-1 ，应用台盼蓝拒染试验检测活力约为85%. 　　2.2 藻酸钙载体的大体及扫描电镜观察 经处理所得的载体为圆柱状、白色，有一定的强度和韧性（Fig1），扫描电镜见柱型藻酸钙载体为具有一定孔隙的网眼状材料