独特型TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体构建及体外表达.doc

　　独特型TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体构建及体外表达 ：李闯, 吴秀丽, 李扬秋, 周羽竝, 陈少华, 杨力建, 朱康儿 【摘要】 　　目的: 构建Jurkat细胞株独特型TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体, 转染后了解其体外表达情况。方法: 根据聚合酶链反应基因扫描（PCRGenescan）检测Jurkat细胞株TCR Vα及Vβ亚家族表达情况, 分别将其所表达的单克隆性的TCR Vα1及TCR Vβ8亚家族基因片段克隆至质粒pIRES的多克隆位点A（MCS A)和多克隆位点B（MCS B)中。通过限制性酶切分析、 序列分析、 RTPCR、 间接免疫荧光、 流式细胞术(FCM)手段鉴定重组表达载体的正确性以及转染A549和Molt4细胞后基因及蛋白的表达情况。结果: 构建了2组TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体, 该表达载体转染A549和Molt4细胞后, 在mRNA和蛋白水平检测到了TCR Vα1和TCR Vβ8的表达。结论: 成功构建了2种独特型Vα1pIRESTCR Vβ8真核表达载体, 为利用特异性TCR基因修饰T细胞的研究提供方法学依据。 【关键词】 Jurkat细胞株 T细胞受体 转基因 　　[Abstract] AIM: To construct the eukaryotic vectors ilies of Jurkat cells onoclonal TCR Vα1 and Vβ8 genes of Jurkat cells ultiple clone site (MCS) A and MCS B of the eukaryotic vector pIRES respectively. Its sequences e cutting and sequence analysis. The expression of TCR mRNA and idiotypic protein in transferred A549 and Molt4 cells munophenotyping fluorescein dyeing and floetry, respectively. RESULTS: TRNA and protein ethod for furthor study of the specific TCR gene modified T cells. 　　[Keyentary determining region 3, CDR3）已经是常规应用于了解T细胞所表达的亚家族和克隆性的技术[1]。近期研究显示将抗原特异的TCR基因转导和修饰正常T细胞后, 可以诱导出大量表达具有目的TCR基因的T细胞, 从而应用于特异性免疫 治疗 等[2, 3]。该研究的基本条件是构建特异性TCRVαTCRVβ双基因表达载体, 并证明其可以在真核细胞中表达。我们首先利用Jurkat细胞株独特型TCR基因构建TCR Vα1pIRESTCR Vβ8表达载体, 并将重组质粒转染至A549和Molt4细胞中, 检测其在真核细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况, 建立了相应的技术, 为进一步研究抗原特异TCR基因表达载体的构建和应用提供了实验方法。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 Jurkat细胞株、 pIRES质粒由本室保存; TRIzol和逆转录酶SurperScript II试剂盒购自Gibco公司; 内切酶Nhe I、 EcoR I、 Xba I、 Sal I购自MBI公司; PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit和LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司; E.Z.N.ATM.Kit胶纯化回收试剂盒购自OMEGA公司; T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司; 胰酶购自Sigma公司; TCR Vβ8单克隆抗体（mAb）购自Serotec公司; Real Mastr Mix和感受态大肠杆菌DH5α购自北京天为时代公司; 倒置相差荧光显微镜为Olympus产品; 流式细胞仪为BD公司产品; 普通PCR扩增仪为BioMetra产品; 荧光定量PCR仪为BIORAD产品; 测序和构建引物合成均在上海英骏生物技术有限公司进行。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RTPCR基因扫描 应用TRIzol试剂盒按常规方法提取Jurkat细胞株总RNA, 应用随机引物法和逆转录酶SurperScript II合成cDNA, PCR扩增管家基因β2M检测cDNA合成质量。利用TCR Vα亚家族（29个）及TCR Vβ亚家族（24个）序列特异性引物对Jurkat细胞株TCR的CDR3区进行RTPCR