Robo1 RNA干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应.pdfVIP

第 42卷第 1期第 42页 华 中科技大学学报 (医学版) Vo1．42 No．1 P．42 2013年 2月 ActaMedUnivSeiTechnolHuazhong Feb． 2013 RobolRNA干扰慢病毒载体的构建及其 基因沉默效应* 李彩娟， 柯 昌斌 ， 田玉科△， 时 代， 何文胜， 卜慧莲， 高 峰 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉 430030 摘要 ：目的 构建 Roundabout(Robo1)siRNA慢病毒载体 ，并在 SKOV3卵巢癌细胞 中鉴定其转染及基因沉默效 果。方法 根据 GenBank中基因信息，采用干扰序列设计软件设计靶点，制备 RobolDNA片段，在 T DNA连接酶作 用下，将线性化的病毒载体GV118与DNA片段制备合成GV118一siRNA 目的质粒，转化感受态细胞 ，对于长出的克隆应 用菌落PCR鉴定，再对 PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对 比分析，重组病毒质粒与另外 2种辅助包装原件载体质粒通 过 Lipofectamine 2000共转染 293T细胞，培养 48h后，收集细胞培养上清液，将病毒浓缩后在 293T细胞 中测定病毒 滴度；并检测病毒载体在工具细胞 SKOV3卵巢癌细胞中的转染效率，实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Westernblot方 法检测 RobolsiRNA慢病毒对 SKOV3中Robol的干扰作用。结果 成功构建 RobolsiRNA慢病毒载体 GV118一siR— NA，病毒滴度为 2×10 TU／mL；用该病毒体外转染 SKOV3卵巢癌细胞 ，当感染复数 (MOI)为 1O时，感染效率大于 9O ；RT—PCR和Westernblot方法检测 Robol基因沉默的效率分别为 76．7 、56．0 。结论 成功构建 了RobolsiR— NA慢病毒载体 GV118-siRNA，该病毒载体在体外转染 SKOV3卵巢癌细胞的效率较高，且具有显著的基因沉默效果。 关键词 ：Roundabout1； 小干扰 RNA； 慢病毒载体 ； 基因沉默 ； 转染 中图分类号 ：Q7 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2013．O1．009 ConstructionofLentivirusVectorofRobolsiRNA andItsSilencingEffects LiCaijuan，KeChangbin，TianYuke△etal DepartmentofAms s0zog ，TongJiHospital，TongJiMedicalCollege，Huazhong UniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China Abstract Objective Toconstructthe1entivirusvectorthatcanencodesiRNAtargetingRoundabout1(Robo1)geneand examinetheefficiencyofitsinfectionandgenesilencingintheSKOV3cells．Methods ThetargetplasmidGV118一siRNA was preparedbyconnectingthe1inearizedvectorGV118andtheDNA sequencebyusingT DNA convertase．Thetargetplasmids weretransformedintocompetentcells．ThegrowncolonieswereidentifiedbycolonyPCR。andthenthepositivecolonieswere sequencedandaligned．Reeombinant1entivirusvectorplasmidsand theothertwoauxiliaryplasmidswereco—transfected into 293T c