EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响.docVIP

　　EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响 ：李友琼， 张雪怡， 曾健 陈巧林 李良菊， 成静， 訾瑞峰， 周天戟 【摘要】 目的： 了解EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响。方法： 构建pSG5/BARF1真核表达载体，转染到EB病毒阴性的胃癌细胞系SGC7901，经RTPCR鉴定，获得BARF1稳定表达的细胞克隆。以pSG5空载体转染细胞为对照，进行细胞凋亡诱导实验、细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和细胞迁移实验。结果： 与对照组相比，BARF1表达细胞组经抗癌药顺铂诱导后的细胞凋亡率显著降低（Plt;0.01），增殖速度显著加快（Plt;0.01），软琼脂集落形成率显著提高（Plt;0.05），细胞迁移能力显著增强（Plt;0.05）。结论： BARF1基因能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性，可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中起重要作用。 【关键词】 EB病毒； BARF1； 胃癌细胞； 细胞生物学行为 ［Abstract］ Objective: To investigate the oncogenic functions of EBVencoded BARF1 gene in gastric epithelial cells.Methods： A pSG5/BARF1 expression vector oderatelydifferentiated gastric cancer cell line SGC7901.The stably transfected cell clones iting dilution and G418 screening, and BARF1 expression ed by RTPCR.The biological behavior analysis minedichloroplatinum(DDP), cell groation assay, as igration test under the control of vacant pSG5 vector transfected clones. Results： BARF1 expression in gastric cancer cells led to more resistant to apoptosis induced by DDP, faster proliferation, higher colony formation rate in soft agar, and stronger migration capability. Conclusion： BARF1 gene had all around oncogenic ability in gastric epithelial cells and may play an important role in the oting EBVassociated gastric carcinoma. ［Key ega公司，质粒和真核细胞DNA提取和琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒购于Axygen公司。限制性DNA内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶及DNA去磷酸化试剂盒购于TaKaRa生物工程公司。细胞转染试剂Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，RPMI1640和DMEM培养基、G418和真核细胞RNA提取试剂Trizol购于Gibco公司。新生牛血清（NCS）购于民海生物工程公司。RTPCR试剂盒购于Toyobo公司。细胞培养板、细胞迁移实验用Transl青霉素和100 g/ml链霉素，培养于37℃，5％ CO2环境中，2～3 d换液1次。 1.2.2 pSG5/BARF1真核表达载体的构建 提取B958细胞DNA作为模板，用PCR扩增BARF1的ORF［4］。产物长度为697 bp，经琼脂糖凝胶电泳回收，然后连接到pGEMT Easy载体，转化大肠埃希菌（E.coli）DH5α并进行蓝白筛选，挑选白色菌落扩增后提取质粒，EcoR Ⅰ酶切后，电泳回收715 bp片段。pSG5载体同样酶切并去磷酸化后，与该片段连接，转化E.coli DH5，挑取菌落扩增提取质粒，酶切鉴定插入方向，并进行DNA序列测定。 1.2.3 细胞转染与克隆 pSG5/BARF1及pSG5对照质粒用Lipofectamine 2000转染细胞，操作按说明书进行。用有限稀释法进行克隆，转染后第3天将细胞消化分散，按每孔100个细胞接种96孔细胞培养板。整个过程用含300 g/ml G418的培养液进行筛选培养，每周换液一次，直至长出抗性克隆，然后扩大培养。 1.2.4 BARF1表达