皮肤血管瘤及血管畸形细胞增殖及凋亡对比探究.doc

皮肤血管瘤及血管畸形细胞增殖及凋亡对比探究[摘要]目的：探讨皮肤血管瘤和血管畸形的细胞凋亡与增殖的平衡关系及与临床生物学行为的可能关系。方法：采用流式细胞．术检测皮肤血管瘤和血管畸形组织中凋亡细胞比率及细胞周期分布，分析细胞凋亡/增殖水平。结果：血管瘤增生期和消退期凋亡/增殖水平出现下调和上调(P＜0.05)，而血管畸形细胞凋亡/增殖水平与正常皮肤相比无显著性差异(P＞0.05)。结论：细胞凋亡/增殖水平在皮肤血管瘤和血管畸形之间存在差异且可能与二者的病理演变过程密切相关。 [关键词]血管瘤；血管畸形；增殖；凋亡 [中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0743－03 自1982年Mulliken和Glowaki将传统意义上的血管瘤分为(真性)血管瘤和血管畸形以来，有关此类疾病的分类方法和相关研究得到了不断的完善和发展，对于血管瘤和血管畸形在组织学、临床生物学行为和诊断治疗方面的对比研究颇多，二者明显不同的病程演变和临床生物学特征也逐渐被认识，但其发生机制尚不明确。本实验通过对不同时期血管瘤、血管畸形和正常皮肤的细胞增殖和凋亡水平进行对比分析，旨在初步探讨两种病变的凋亡与增殖平衡的变化规律及其与临床生物学行为的关系。 1　材料和方法 1．1　材料：选用2005年2月～2006年1月临床诊断为血管瘤和血管畸形的手术切除的新鲜标本56例，部位为颌面部、四肢及躯干部。标本均分为两份，一部分冻存备用(为尽量减少冻存对细胞存活率的影响，采用慢速分步降温，先于4℃冷平衡15min，然后-20℃ 30 min，最后置入-80℃冰箱保存)，一部分经10％甲醛固定后行常规石蜡包埋，制4μm厚连续切片，HE染色后光镜下根据Mulliken等的组织学标准并结合疾病的临床生物学行为将病变分类：血管瘤40例，年龄12天～38岁，其中增生期(或叫增殖期20例，消退期(或叫退化期)20例；血管畸形13例，年龄2月～60岁；另有3例病理证实非血管瘤和血管畸形。所有标本术前未行干预性治疗，术后病理确诊，无合并结缔组织疾病、免疫系统疾病及其他重要脏器疾病。同时取20例正常全厚皮肤作为对照。 1．2　方法：应用流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡和细胞周期分布。 1．2．1　单细胞悬液的制备：组织块解冻后置于70％冷乙醇溶液4℃固定24h。将组织块置于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，以眼科镊子轻搓组织，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液以300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以800r/min离心2min。去除上清液，加入PBS液调整单细胞悬液为1×106/ml。 1．2．2　细胞凋亡和细胞周期测定：取单细胞悬液100μl，加入碘化丙啶(PI)1ml 4℃避光染色30min，以500目铜网过滤即可上机检测。 1．2．3　流式细胞仪检测条件及参数：采用美国Beckman Coulter公司的Epics－XL Ⅱ型流式细胞仪，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，应用Multicycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前调整仪器CV值在2％以内。 1．2．4　结果判定：应用DNA细胞周期分析软件，获取DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞增殖活性，PI=(S＋G2/M)/(G0//G1+S+G2/M)×100％。在DNA直方图上于正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(sub－G1)，其占分析细胞的百分比经分析软件处理后得出细胞凋亡率(apoptosis rates，AR)。 1．3统计学处理：所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析。样本均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 2　结果 2．1　HE染色结果：光镜下增生期血管瘤内皮细胞大量增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染，血管腔呈窦隙样或无明显血管腔；消退期血管瘤内皮细胞数目减少，内皮细胞核扁平，血管腔明显，血管周围纤维结缔组织增多。血管畸形血管管腔呈异常扩张，管壁由扁平的内皮细胞构成，胞核扁平，无内皮细胞增多；正常皮肤中的毛细血管由1～2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄：仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。 2．2　细胞凋亡率、增殖指数结果：血管瘤各组AR，PI及AR/PI与血管畸形和正常皮肤之间差异均有统计学意义，而血管畸形和正常皮肤之间均无明显差异(P＞0.05)。见表1。 3　讨论 传统上血管瘤一词用于定义多种脉管性病变，并根据形态学分类分为毛细血管瘤(包括葡萄酒色斑与草莓状血管瘤)、海