SR-BI过表达对J774细胞胆固醇转运以及TNF-α和MCP-1表达影响.pdf

SR-BI 过表达对J774 细胞胆固醇转运以及TNF-α和MCP-1 表达的影响 研究生：冯惊涛 导 师：易光辉 教授 专 业：病理学与病理生理学 中 文 摘 要 研究背景：动脉粥样硬化（atherosclerosis, As ）及其病症是危害人类生命和健康 的第一大杀手，其病灶（脂质条纹、纤维斑块、粥样斑块和有并发病变的病症） 的发生发展与血浆脂质和血管炎症密切相关。B 类 I 型清道夫受体（scavenger receptor class B type I, SR-BI ）是第一个在分子水平上证实的位于细胞膜表面的高 密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)受体，是体内发挥抗动脉粥样硬化作用 的主要受体之一，它可以有效地抑制动脉粥样斑块的形成和延缓动脉粥样硬化的 进展。SR-BI 是参与逆向胆固醇转运（reverse cholesterol transport, RCT ）、调节脂 质代谢的重要受体，它在RCT 的起点（动脉壁的单核/ 巨噬细胞等）和终点（肝 脏和类固醇激素生成组织等）都具有丰富的表达。在RCT 的起点，它可以通过 改变细胞膜胆固醇的分布，介导细胞的游离胆固醇（FC ）流出到HDL ，发挥抗 动脉粥样硬化的作用；在RCT 的终点，它可以通过介导对HDL-CE 的选择性摄 取，从而降低血浆胆固醇水平、刺激 RCT ，发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而 单核/ 巨噬细胞SR-BI 的表达可以在不影响血脂水平和胆固醇流出的情况下发挥 抗动脉粥样硬化作用，因此单核/ 巨噬细胞表达SR-BI 的抗动脉粥样硬化作用应 该还有不依赖于其介导胆固醇流出的重要机制。 目的：通过构建人SR-BI （hSR-BI ）真核表达载体、使细胞瞬时过表达SR-BI， 观察其对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF ）α 和单核细胞趋化因子-1 （monocyte chemoattractant protein, MCP-1 ）表达的影响，初步探讨单核/ 巨噬细 胞SR-BI 抗动脉粥样硬化的作用机制。 方法：获得hSR-BI cDNA ，用PCR 的方法（上下游引物分别含有XbaI 和KpnI 限制性内切酶酶切位点）克隆hSR-BI 基因全长；用限制性内切酶XbaI 和KpnI 双酶切PCR 克隆的hSR-BI cDNA 和真核表达载体pcDNA3.1(-) ；DNA 连接酶连 7 接限制性内切酶酶切的 hSR-BI 基因和 pcDNA3.1(-) ；基因测序法检测 hSR-BI cDNA 的碱基序列；瞬时转染法转染J774 细胞和 3T3-L1 细胞；设计人鼠共用 SR-BI 引物、购买人鼠共抗SR-BI 抗体，用RT-PCR 和estern blot 的方法检测各 3 组细胞的SR-BI 表达；用液体闪烁计数法检测流入和流出细胞的[ H]胆固醇量， 用高效液相色谱仪检测细胞的总胆固醇（TC ）和FC 含量，分析细胞过表达SR-BI 的胆固醇转运功能；用RT-PCR 检测细胞TNF-α和MCP-1 两种细胞因子的mRNA 水平，分析过表达SR-BI 对TNF-α和MCP-1 两种细胞因子表达的影响。 结果：①成功构建了hSR-BI 真核表达载体pcDNA3.1(-)-hSR-BI ，通过基因测序 表明其碱基序列正确。②与对照组和空载体转染的 J774 细胞相比， pcDNA3.1(-)-hSR-BI 转染的J774 细胞表达SR-BI 升高（n=3, P0.05 ）；与空载体 转染的J774 细胞相比，pcDNA3.1(-)-hSR-BI 转染的J774 细胞的胆固醇双向转运 和胆固醇蓄积功能增强。③与对照组和空载体转染的J774 细胞和3T3-L1 细胞相 比，pcDNA3.1(-)-hSR-