Annexin A3在稳定培养卵巢癌铂类耐药细胞系中的表达和其对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响.pdfVIP

中国医学科学院北京协和医学院博士研究生论文 中文摘要 研究背景和目的 卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，虽经过规范化的治疗，包括理想的肿瘤 细胞减灭术和以铂类和／或紫杉醇为基础的联合化疗，晚期卵巢癌的5年生存率仍徘 徊在15％--20％左右n1，对化疗药物产生耐药性是造成卵巢癌5年生存率得不到改 善的一个重要原因。 化疗耐药可分为原发性和继发性两种。约有15％--20％的卵巢癌患者对顺铂等 化疗药物原发耐药。多数患者在接受化疗的过程中逐渐产生耐药性，临床表现规范 化疗停药6个月内临床复发、用药期间出现部分缓解、最好的疗效为稳定等。肿瘤 的耐药现象一方面与抗肿瘤药物的反复作用引起基因的突变或后遗传性改变有关， 另一方面也有赖于肿瘤中已经存在的耐药细胞亚群的选择性生长。 铂类的耐药机制尚未明确，主要涉及以下几个方面：l、药物在肿瘤细胞内蓄 积减少，包括细胞对药物的摄入减少和主动外排增加；2、肿瘤细胞对抗肿瘤药物 的转化和解毒功能增强；3、肿瘤细胞内DNA修复功能增强；4、铂类药物诱导肿 瘤细胞凋亡的过程中，细胞凋亡传导通路上的调节蛋白的表达改变等。作为目前临 床治疗卵巢癌的一线化疗药物，阐明其耐药机制，对逆转临床耐药和提高患者5年 生存率具有重要的意义。 2003年，本课题组受北京协和医院重点基金资助，开展了卵巢癌耐药相关蛋白 的比较蛋白质组分析、寻找耐药相关候选蛋白的研究。在通过体外诱导构建卵巢癌 细胞的蛋白质表达图谱，鉴定差异表达蛋白，筛选获得目标耐药候选蛋白Annexin 5 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生论文 A3。利用基因工程技术，构建含正义、反义AnnexinA3序列的真核表达质粒，人 为地上调或下调AnnexinA3蛋白的表达水平，验证了AnnexinA3蛋白与铂类耐药 的相关性，进而又从动物水平和人体水平进一步探讨其在体内发挥耐药功能的可能 性。 近期研究表明，细胞耐药现象可能与抗癌药物引起的细胞凋亡程序缺陷有关。 顺铂能够诱导肿瘤细胞凋亡，控制细胞凋亡途径有关的信号传导通路、调节蛋白的 异常表达可能与细胞的药物敏感性相关。 本研究在前期工作的基础上，首先检测了卵巢癌耐药细胞系在体外稳定培养过 程中耐药性的维持及AnnexinA3蛋白的表达。采用基因工程技术，构建含正义和 A3在顺铂诱导细胞凋亡通路中的可能作用机制。 研究内容及方法 时间复苏和持续培养两个不同角度探讨耐药细胞系耐药性的维持。比较两细胞系细 胞形态(姬姆萨一瑞氏染色)、生长曲线(7天培养法)、生长周期(流式细胞仪检 酶切、测序后基因比对鉴定重组载体。感染包装细胞PT67，转染NIH3T3细胞测 blot鉴定细胞转染后 定病毒滴度。转染相应的肿瘤细胞，筛选阳性克隆，Western Annexin A3表达水平的变化。扩增转染后经筛选鉴定的阳性克隆，MTT法比较转 染前后细胞的耐药性。比较转染前后细胞的形态(姬姆萨一瑞氏染色)、生长曲线 (7天培养法)、生长周期(流式细胞仪检测)等生物学特性的差异。 3、顺铂作用24小时后，采用流式细胞仪分别检测卵巢癌化疗敏感、耐药、 6 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生论文 以及转染正义、反义AnnexinA3的细胞凋亡率。以不同浓度的顺铂作用24小时， Western 8及Survivin 9、Caspase blot观察凋亡途径上的作用蛋白Caspase3、Caspase 表达水平的差异。 研究结果 l、采用MTT法前后间隔5个月、分别三次测定卵巢癌耐药细胞的耐药指数。 间点检测细胞耐药指数，差异无统计学意义(尸0．05)。姬姆萨一瑞氏染色结果显 改变不明显。耐药细胞的群体倍增时间延长。耐药细胞的细胞周期中，GO—G1期细 A3表达水平增高。