EstA、CbpA对HTP--1细胞ICAM--1表达影响研究和肺炎链球菌快速诊断.pdfVIP

．里型堕堂堕堡主兰垡鲨茎 ．一—— 。———————————————————————————————————一一。 一__ 中文摘要 球菌快速诊断 目的： cpsA和spn9802两种引物基因定量检测肺炎链球菌检测方法。 方法： 1 分别将含酶切位点的眙删、CbpA扩增产物与含相同酶切位点的pMDl8T双酶 酶切鉴定后将pET28(a+)表达载体经与瓜棚、CbpA扩增产物相同的酶酶 酶切鉴定后转化至BL21。根据不同的温度和不同的IPTG浓度分别对含pET28 电泳进行分析，确定最佳诱导温度和IPTG浓度。根据诱导蛋白的HIS标签， 将目的蛋白经与HIS标签有亲合性的镍一琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化。根据 梯度纯化结果确定最佳纯化条件。纯化蛋白经SDS电泳进行分析，根 据电泳分析的结果将目的纯化蛋白液通过脱盐柱脱盐并经SDS电泳确 定。根据染料结合法，应用碧云天BCA试剂盒检测重组蛋白浓度。 2 上海细胞研究所购得人单核细胞白血病细胞THP一1，细胞培养至1×106经 PMA作用浓度刺激12h，单核细胞转化为吞噬细胞，用不同浓度的纯化蛋白 刺激转化不同时间。刺激后的细胞经Trizol法提取RNA，逆转录后，以GAPDH 为内参基因通过荧光定量PCR法检测刺激后THP一1中ICAM—lmRNA的变化。 3 根据基因库中两种基因的序列，结合参考文献根据NCBIBLAST比对结果和 primer5．0中引物的各种参数情况设计出特异性引物，对127例温州医学院 附属第二医院肺炎患者痰液标本用胰酶处理后根据传统方法提取DNA，用 ABl7500进行荧光定量PCR检测，根据每种引物检测出的最低限和对100株 肺炎链球茵和50株非肺炎链球菌的检测结果，比较两种方法检测的敏感性 和特异性，并用传统痰培养方法同时检测标本。 6 ．墨塑堕堂堕堡圭堂垡笙茎一．—— _一———————————————————————————————————一一 结果： 1 IPTG条件下诱导18h后表达清晰、 条件的优化确定EstA蛋白在24。C、0．5EM 验确定，EstA蛋白在100mM咪唑浓度、CbpA蛋白在500mM咪唑浓度时纯度 最高。镍一琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化，通过脱盐柱脱盐后获得纯蛋白。经纯 g／ml的 化试剂盒纯化后分别获得浓度为3390g／m1、1590g／ml和74．80 g／ml和82pg／ml的CbpA蛋白。 EstA蛋白，浓度为1650g／ml、1230 2 g／ml 融合蛋白EstA分别以33．90g／m1、15．9pg／ml、11．30g／ml与7．480 g／ml时刺激成功诱导的THP_1细胞 7．46+-1．81、32±1．64。浓度为7．480 20h，ICAM一1在检测限以下。随着浓度增加，工CAM_1／GAPDH值逐渐增高， 33．90g／ml刺激时ICAM一1／GAPDH值最高。回归分析成指数曲线，相关系数 g／m1分别刺激成功诱导的THP—l细胞2h、4h、8h、20h， 达0．9840。33．90 回归分析成指数曲线，相关系数达0．9934。 融合蛋白CbpA分别以16．50g／ml、12．30g／ml、8．20g／ml刺激成功诱导 g／ml刺激时 80+1．75。随着浓度增加，ICAM_1／GAPDH值逐渐