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参附注射液对脑再灌注损伤中细胞凋亡影响【摘要】目的 探讨参附注射液（Shenfu injection，SF）对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）中脑神经元细胞凋亡及血红素氧合酶—1（heme oxygenase—1， HO—1）表达的影响，并探讨其可能的机制。方法 SD雄性大鼠42只，随机（随机数字法）分为假手术组（Sham组）、缺血—再灌注组（IR组）、参附注射液组（SF组），制造大脑中动脉阻塞模型，缺血2 h后再灌注3 h、6 h。SF组于再灌注时腹腔注射参附注射液10 ml/kg。光镜和电镜下观察脑组织神经细胞形态学变化，用Annexin—V—PI双染法通过流式细胞仪检测脑织凋亡细胞并计算凋亡率，应用RT—PCR技术检测HO—1。结果 IR组与Sham组相比，3、6 h时点脑组织凋亡率明显增加（ P 0.8 mg/ml）和乌头类生物碱（0.1 mg/ml）。缺血—再灌注组和假手术组予腹腔注射等量生理盐水。假手术组除栓线进线1.5 cm外，其余步骤相同。分别于再灌注后3 h，6 h时点处死大鼠，取脑组织以备检测。 1.3 大鼠神经功能Zea Longa评分[4] ①无神经功能缺失症状，活动正常者，0分；②不能完全伸展对侧前爪，1分；③动物爬行时出现追尾现象，2分；④身体向偏瘫侧倾倒者，3分；⑤不能自发行走，意识丧失者，4分。评为0分和4分者均被剔除，神经功能评价在取材前进行。 1.4 检测指标及方法 1.4.1 脑组织HE染色 于实验结束时点将动物麻醉，经左心室心尖部插管至主动脉口，快速灌注生理盐水约250 ml 进行心脏灌洗，然后用4%多聚甲醛灌洗200 ml固定，断头取脑，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观察各组大鼠脑组织神经细胞形态学变化。 1.4.2 脑组织电镜观察 每组各取2只做电镜检查。在试验动物海马缺血区边缘取1 mm3大小脑组织，2.5%戊二醛固定，送电镜室，经脱水，包埋切片，醋酸铀—枸橼酸铅复染，予以透射电镜下观察脑组织超微结构变化。 1.4.3 流式细胞分析法测定细胞凋亡率 脑组织用分散、剪碎、过滤，收集单细胞悬液，反复洗涤、离心，加入缓冲液、Annexin—V—异硫氰酸荧光素（FITC）、1 μl碘化丙啶（PI），振荡混匀，避光放置15 min，以流式细胞仪（BD FACSCalibur）检测凋亡率。 1.4.4 脑组织HO—1的表达 取Sham组、IR组、SF组各时间点大鼠脑组织进行RT—PCR分析，提取组织总RNA，以总RNA 2 μg进行逆转录，逆转录体系15 μl，逆转录后行PCR扩增，体系中HO—1上游引物序列为：5 TGCTGACAGAGGAACACAAAGA 3，下游引物序列为：5 ACAAAGGAAGACACAGGAAGGG 3，产物长度为354 bp。扩增参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共32个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，取反应液5 μl进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物，以Quantity One软件进行电泳条带半定量分析，分别以IR组、SF组与Sham组的吸光度积分比值作为目的基因的表达水平。 1.5 统计学方法 定量数据以均数±标准差（ x±s ）表示。用Stata 9.0 软件进行统计学分析。各组间应用方差分析检验方差齐性，方差齐者进行比较，组间两两比较采用成组 t 检验，以 P 0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 光镜观察结果 Sham组脑组织神经元细胞层次排列整齐，细胞形态正常，核仁清楚，未见水肿、坏死。IR组大鼠脑组织皮质及细胞明显水肿，脑基质疏松，出现点状坏死灶，细胞胞体缩小伴软化灶形成，细胞间隙明显增大。SF组神经细胞水肿、变性及坏死的数量较IR组显著减少，结构稍紊乱，神经元细胞层次排列尚整齐，细胞核病变减轻。见图1。 　　2.2 电镜观察结果 与Sham组相比，IR组神经元变性，胞浆疏松，线粒体内嵴消失，数量减少，核糖体分布稀疏，细胞周围空泡化明显；胞核形态异常，核膜皱缩，部分有断裂，染色质分布异常，出现凝聚征。SF组细胞核染色质边集，线粒体呈圆形或卵圆形，嵴较清楚，微绒毛较完整，板层小体结构较完整，少数线粒体轻度肿胀。见图2。 2.3 脑组织凋亡率 3 h、6 h时点，IR组、SF组较Sham组脑组织凋亡率明显增加，SF组脑组织凋亡率较IR组均明显降低，差异具有统计学意义；SF组6 h时点凋亡率较3 h显著减少（ t =—2.8613， P =0.0143）， IR组两时点间无明显变化（ t =—0.483