哮喘患者外周血单个核细胞OGG1表达及DNA损伤氧化损伤.pdfVIP

哮喘患者外周血单个核细胞 OGG1 表达与 DNA 损伤氧化损伤 摘要 目的：氧化应激指体内氧化和抗氧化失衡引起的生理生化过程，近年来 研究认为氧化应激参与了哮喘的发生发展，是导致重症哮喘发生的重要 原因之一，能够引起细胞 DNA 损伤。作为胞内修复蛋白 8-羟基鸟嘌呤 DNA 糖苷酶，主要受氧化应激调节，其表达特异性，表达量的多少以及 与氧化损伤的程度的关系尚有许多疑问。本实验着重哮喘患者外周血单 个核细胞，探讨 8-羟基鸟嘌呤 DNA 糖苷酶 (简称：OGG1)在哮喘患者外周 血单个核细胞中的表达与氧化应激相关性和 DNA 氧化损伤情况。方法： 收集 2011.2-2011.12 泸州医学院附属医院呼吸内科就诊的哮喘患者 16 例，按照 GINA （全球哮喘防治创议）标准诊断程序明确支气管哮喘诊断， 按照 GINA 指南急性发作期严重程度分级分为轻中度哮喘组，重症哮喘 组，正常人作为对照。所有研究患者均处于急性发作期，对照组为健康 体检者。分别抽取外周静脉血，分离血清备用；淋巴细胞分离液分离单 个核细胞 （PBMC）备用。分别用荧光探针 DCF-DA 和 DHE 标记测量各组 中胞内平均荧光强度，并用 WST 法测量外周血血清中 SOD 表达，检测体 内氧化应激情况；同时取外周血单个核细胞做单细胞凝胶电泳实验，检 测其外周血单个核细胞中 DNA 损伤情况；为测量外周血单个核细胞胞内 蛋白 OGG1 表达使用间接荧光免疫方法流式细胞仪测量，并在激光共聚 焦观察细胞形态。同理，运用间接荧光免疫检测外周血中单个核细胞胞 内的转录活化因子NF- κB 表达。结果均使用 SPSS13.0 软件统计软件， 结果以均数±标准差 （ ）表示。组间比较采用 q 检验，相关分析采 x  s 用直线相关分析；以 P0.05 为差异具有统计学意义。结果：1.研究对 象一般情况观察：用药前，轻中患者组均能闻及哮鸣音，3 例可闻及少 许湿罗音，3 例出现口唇发绀，吸氧前 SpO2 为 54-95% ，吸氧后血气提 示均无呼吸衰竭。而重症组呼吸困难均明显，口唇发绀，端坐呼吸。5 例患者烦躁不安，3 例出现呼吸极度困难，双肺大量哮鸣音和较多湿罗 音。吸氧前 SpO2 均小于 89%。SPO2 为 43-84%，吸氧后血气提示有Ⅱ型 呼吸衰竭。所有患者体温均正常。2.荧光探针 DCFH-DA 标记外周单个核 细胞平均荧光强度：流式细胞仪结果显示，轻中度和重症组平均荧光强 度分别为 (37.81±11.67，65.8±19.27) ，与正常对照组平均荧光强度 相比 （10.90±3.01）明显增高，差异均有统计学意义。在重症哮喘患 者平均荧光强度明显高于正常组 P=0.002，与轻中度哮喘相比荧光强度 也明显增强 P=0.046；酶标仪测量结果显示：OD 值在轻中组和重症组与 对照组相比，增高倍数为 （1.29±0.38,2.67±1.13）；重症组与轻中 度组相比亦明显增高，P=0.00139，差异有统计学意义。轻中度组较正 常组明显增强 P=0.011，差异具有统计学意义。细胞离心后，激光共聚 焦下观察，轻中组和重症组平均荧光强度分别为 （15.63±5.82,35.56 ±16.15）,与正常对照组 （6.08±6.11）荧光强度明显增高。P 值分别 为 0.019,0.003。重症组与轻中度相比，P=0.029，差异具有统计学意义。 同理用 DHE 探针标记测量胞内 ROS 激光共聚焦下观察，轻中组和重症组 平均荧光强度分别为 （16.70±14.95,33.52±15.58），与对照组荧光 强度 （2.20±1.47）相比明显增强。重症组与轻中组比较，P=0.002,轻 中度与正常组相比，P=0.00036。差异具有统计学意义荧光强度明显增 强。3. DNA 损伤情况（单细胞凝胶电泳激光共聚焦下测定 DNA 拖尾长度）： 用单细胞凝胶电泳的方法检测外周单个核细胞 DNA 损伤情况，图像用 cometscore 软件分析尾长，轻中组，重症组尾长分别为 （22.27 ± 22.26,99.12±90.97,），明显长于对照组 （0.70±0.62），差异具有 统计学意义 （p0.05）。重症哮喘组彗星实验拖尾最长，轻中组长于正 常组。重症哮喘与正常组和轻中组相比，尾长更长 p0.05，轻中度组 尾长长于正常组 p0.05。4. 外周单个核细胞 OGG1 表达水平：采用间接 荧光免疫流