siRNA对K562细胞α珠蛋白肽链mRNA表达和细胞增殖影响.pdfVIP

前言 B地中海贫血是我国南方地区常见血液系统遗传疾病¨1，在广西、广 东、云南、贵州等省份比较常见。其发病机制为基因缺陷造成的B珠蛋白 肽链mRNA合成减少或缺如，导致血红蛋白A的合成减少，Q珠蛋白肽链mRNA 表达相对增多，Q、B链的结构正常而量的对比异常，多余的Q链沉积形 成包涵体造成红细胞的破坏增加，从而造成溶血性贫血。通过抑制Q链mRNA 的相对过量表达，减少Q珠蛋白肽链的相对过量生成，从而可以纠正Q、 13链在数量上的对比异常。 源基因表达的基因表达调控技术‘2¨3’。外源性的dsRNA在进入细胞后被属 于RNAse 进一步减少相关蛋白质的生成‘61【7¨81，从而达到抑制同源基因表达的目的。 K562为慢性粒细胞性白血病急性红白血病变细胞系‘?1，含有包括Q链在内 的多种珠蛋白肽链基因|t01)高表达Q珠蛋白肽链mRNAⅢ1‘此1m川41。 过脂质体01 mRNA的表达水平的变化以及siRNh对K562细胞增殖情况的影响。 材料与方法 1．1K562细胞的培养 慢性粒细胞性白血病急性红白血病变细胞株K562(购自中国科学院上 3天传代一次，细胞生长状态良好，增殖旺盛(见图1)。 图1 K562细胞的生长状态 1．2 siRNA的设计与合成 基因库号码为NM 为≤50％，悬垂端以uU结尾，得出以下序列(5’一3’)： Sensestrand：CGGUAUUUGGAGGUCAGCAUU： Antisense strand：UGCUGACCUCCAAAUACCGUU； u 制成20mol／L溶液，-200C避光保存备用。 1．3 siRNA的转染 及抗生素)，以使24小时后行转染时细胞处于对数生长期，增殖能力强， 将细胞浓度调整为1×10。／ml，以每孔500u1铺种于24孔板，铺板24小 使之混匀，同时设置相应脂质体组及空白对照组(脂质体组只加入等量 到6小时内按10％的总体积比于每孔中加入胎牛血清，置入C02恒温培养箱 平及CCK一8测试细胞增殖能力。 1．4 RNA的提取及逆转录反应 260 凝胶电泳鉴定总RNA的完整性，并经紫外分光光度计测量总RNA的OD 值、OD 260／0D u 280值、OD 280值并计算其浓度和纯度后，取1g的总RNA， 依次加入以下试剂行逆转录反应合成cDNA：10×逆转录缓冲液(10× Buffer)2u 2u1，40 0．5 1，lOmmol／L的dNTPU／ul的RNasinu1，25mmol／L u1，5u／ul的AMV酶1|l pl， 的MgCl：4 1，2．5pmol／u1的Oligo引物1 u 最后以DEPC·H。O补足20 热灭活反应5min，之后置于一200C储存备用。 1．5实时荧光定量PCR分析mRNA表达水平 采用SYBR 18u u 下：二乙基焦磷酰胺一H20 1．5|l l，25mmol／L的MgCl2l，缓冲液(10×Buffer)2．5u1，耐热DNA l，SYBR u 聚合酶(Taq酶)0．2uGREEN荧光染料0．3l，10umol／L上游 u u 引物0．5l，10umol／L下游引物0．5u1，cDNA模板11，总的反应体积 ii 为25