应用SELDI-TOF-MS技术地分析化疗药物对膀胱癌细胞株细胞内蛋白表达影响.pdfVIP

2．1细胞培养 4天换液，传代一次。 2，2唪哗蓝(MTT)比色实验 EPI溶于2ml的生理盐水，配 2．2．1分别配制含EPI和MMC的细胞培养液首先将10mg 制成5mg／ml的EPI溶液；将2mg 6、30、150mg／L。 每孔加入1509l cxl00％， 仪卜测定各孔光密度(0D)，记录结果，按下列公式，抑制率=(ODc-ODT)／OD 计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率，绘制细胞生长曲线。 ODc为对照组光密度值，ODT为实验组吸光度值。以药物抑制百分率为纵坐标，药物 有效浓度(IC50)(见图1)，以IC50值作为干预细胞的药物浓度。 2．4细胞总蛋白的提取 25cm2培养瓶中，每瓶4ml，37C培养箱中培养24h。 MMC组和EPI组分别为终浓度为10 EPI的完全培养液。 mg／LMMC和5mgm 含0．5ml的裂解～结合缓冲液的2ml的EP管中，剧烈振荡。 2．4．4按l：2的比例加入lml的抽提试剂，振荡均匀，4C静置10rain。 2．4．5 分下层相，保留两相中间的蛋白絮状物。加入lml纯乙醇洗涤沉淀。 2．4．6 室温空气干燥沉淀。置一80℃冰箱保存。 2．5细胞总蛋白溶液样品的制备 2．5．1 Buffer，PH2．O)稀释，涡 每个装有蛋白的EP管中加1009l结合缓冲液(WCX2 旋60秒。 2．5．2取20雎I上述蛋白溶液，加入209l DTT)，置微型振荡器400--600转／分，振荡5min。 2．5．3上述40脚混合物中再加180I_tlWCX2Buffer(PH 2min，留取E清液。准备上机。 2．6 WCX2蛋白芯片操作步骤 2．6．1 WCX2Buffer(PH 将芯片装入生物芯片处理器，每孔加A．200pI 2．O)置微犁振 荡器(MSI)400～600转，分，振荡5min，然后甩干缓冲液。 Buffer(PH 2．6．2生物芯片处理器的每孔再加入200山WCX24．O)置微型振荡器(MSI) 400～600转／分，振荡5min，然后甩干缓冲液，备有。 2．6．3在芯片处理器每孔加入looⅢ处理好的样品，置MSi400～600转／分，4C振荡1．5h。 2．0)室温置MSI 甩干样品，每孔加入200川的结合缓冲液(PH 400-～600转／分，振荡5min， 甩去孔中液体(注意不要甩的太干)，再次加入结合缓冲液，200pl重复操作一次，最后每 孔加入200ⅢHPLC水，立刻甩出。 2．6．4立刻拆开芯片处理器，取出芯片后待干后，在每个加样孔上加llalSPA，待干后， 重复一次。待干燥后，用蛋白质芯片阅读机进行质谱分析。 2．7数据采集和结果分析蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSII—C型读取数据。 ②激光能量195；@检测灵敏度8：④飞行时间信号自动收集。在每次实验数据收集前，用 3．0版本的分析软件自动采集数据，然后用BiomarkerWizard3．0和 用Ciphergenproteinchip BiomarkerPatternsSoftware 3．0软件分析各组间的蛋白质谱差异。筛选条件设为，有意义蛋 差l倍以上。 结果 lMTT法 1．1各浓度对应的OD值(表1)及各浓度的抑制率(表2) 表l药物作用BIU．87细胞的光密度