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苦参提取物对红细胞形貌影响及相关机理探究 　 作者：张晓宇，宋丽晶， 刘威， 何晓红 【摘要】 　　目的应用原子力显微镜（AFM）观察苦参提取物（RSF）在低于临界溶血浓度时对红细胞表面形貌的影响，并探讨其相关机理。方法红细胞悬液与 0.5，2 g·L-1 剂量 RSF 作用后，应用 AFM 观察红细胞形貌，测定细胞内 Ca2+ 浓度及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性。结果AFM 形貌图显示 RSF 作用使红细胞凹陷加深；超微结构观察显示 RSF 引起红细胞膜表面凹凸增强及颗粒聚集；同时，红细胞内 Ca2+ 浓度升高，Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低。结论RSF 中苦参碱类化合物与细胞膜中磷脂作用引起膜透性改变及膜表面蛋白质聚集，改变红细胞内骨架结构，引起红细胞表面形貌的改变，该变化与胞内 Ca2+ 浓度升高及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低相关。 【关键词】 AFM； 红细胞； 苦参提取物； 钙离子浓度； Ca2+-Mg2+-ATPase 　　随着中药研究的深入，现代仪器及技术逐步应用到中药研究领域，拓展了中药基础研究的范围，加深了中药药理作用机理的探讨。近年来，一些生物学家把利用原子力显微镜（AFM）对生物大分子直接观察的技术引入中药研究领域，与扫描电镜相比, AFM 无需复杂制片过程及严格的真空观察条件，具有纳米水平分辨率，能够实现对活细胞表面超精细结构三维数据分析，这些优点使 AFM 成为研究物质表面形貌的重要仪器。特别在探讨中药提取物等外源性物质对红细胞膜结构性能影响方面，AFM 观测成为一种精细而直观的观察手段［1～5］。 　　苦参Radix Sophorae Flavescentis为药用豆科植物苦参的干燥根，主要化学成分及药理活性成分为生物碱类和黄酮类［6］。其药理活性以抗炎抑菌、抗病毒、抗肿瘤为主，临床上广泛用于治疗慢性肝炎、肝损伤、溃疡、心率失常、黄疸、痈肿、发热等病症，其生物碱类提取物也用于杀虫剂［7,8］。苦参提取物的药理作用及有效成分提取已经有了较为深入的研究，但该提取物对红细胞表面形貌的影响、量效关系及相关机理还有待于进一步深入探索。本文应用 AFM 观察苦参提取物（RSF）在低于临界溶血浓度下作用引起红细胞形貌变化，并对 RSF 引起红细胞内的游离钙浓度变化及对 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性的影响进行了较为深入的探讨。 　　1 仪器与材料 　　1.1 仪器BerMad 2000 原子力显微镜（西班牙），JASCO V-550 UV-vis 分光光度计（日本） JASCO FP 6500型荧光分光光度计（日本）。 　　1.2 试药新鲜人抗凝血由长春市中心血站提供，肝素购于华美公司，钙荧光探针Flou-3-AM为美国分子探针公司产品，DMSO为美国sigma 产品，Ca2+-Mg2+-ATPase 测试试剂盒购于南京建成生物工程公司，苦参水提取物（RSF）由吉林省中医中药科学院中药研究所提供。 　　2 方法 　　2.1 试剂配制及样品处理RSF用PBE缓冲液 (Na2HPO4/NaH2PO4, 10 mmol·L-1, EDTA 1 mmol·L-1, pH=7.4) 溶解至终浓度10 g·L-1，超声处理30 min，16000 r/min 离心，上清液用于实验。Fluo-3-AM溶于DMSO配成浓度为1 g·L-1储备液，-20℃保存，使用浓度为5 μmol·L-1。平衡盐溶液HBS：NaCl, 123 mmol·L-1；CaCl2, 1 mmol·L-1 KCl, 5 mmol·L-1；MgCl2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。无钙平衡盐溶液：NaCl, 125 mmol·L-1；KCl, 5 mmol·L-1； MgCl2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。红细胞悬液： 取抗凝血，离心收集红细胞，用 HBS 缓冲液清洗 2 次，2 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉积的红细胞用 HBS 稀释至 2～4 倍体积，4℃ 保存，用前洗涤，以 HBS 缓冲液配制成 4% (V∶V) 的红细胞悬液。 　　2.2 RSF对红细胞溶血率的测定取红细胞悬液，按等体积加入已处理RSF至终浓度为5，10，15，20 g·L-1，参比采用同体积HBS缓冲液代替红细胞悬液。37℃ 温育2 h，期间保持混合充分，离心，测定上清液540 nm处吸光度A。完全溶血红细胞悬液按文献［9］方法制备，以完全溶血吸光度值为A100%，未加药物样品吸光度值为A0，相对溶血率大于 5 % 为溶血，