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兔角膜上皮细胞体外原代培养方法探究 　【摘要】 目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（Plt;0.05）；在16 h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（Plt;0.05）。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。 【关键词】 角膜； 上皮细胞； 原代细胞培养； 兔 角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础，近年来，随着研究深入，对角膜细胞成分培养提出了更高要求。在此，我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法，以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法，现将实验结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 健康新西兰白兔6只，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg,由东南大学实验动物中心提供与饲养。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明，无眼前节病变。 1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12（Gibco,USA)，胎牛血清（中美合资兰州民海生物），胰蛋白酶（Gibco,USA），EDTA（乙二胺四乙酸二钠，AMRESCO 分装），MTT（Sigma，USA），CO2培养箱（Heal Force HF121UV），倒置相差显微镜（OLYMPUS CKX41，Japan），酶标仪（Bio-rad Model 860）。 1.1.3 培养液的制备 采用DMEM/F12=1∶1的混合液，内含10 mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素和100×103 U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4。 1.2 实验方法 1.2.1 取材 取新西兰白兔6只，共12眼，以空气栓塞法处死兔，无菌条件下迅速摘取眼球，用PBS反复冲洗后浸泡于含青、链霉素1 000×103 U·L-1 4 ℃ PBS中10 min,待用。 1.2.2 消化法原代培养角膜上皮细胞 在超净工作台上将眼球用PBS冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用DMEM/F12培养液冲洗1～2次；在50 mm培养皿中加0.25%胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液约1 ml，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养箱中消化20～30 min后翻转角膜片，轻轻冲洗上皮面，将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化；在培养皿中再次加入消化液，置培养箱中消化10 min后终止消化；将两次消化的细胞悬液离心6～8 min(1 000 r·min-1)，弃上清，加入全培养液（内含10 mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素、100×103 U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4），吹打混匀。计数制成5×105～1×106 ml-1细胞悬液，接种于培养瓶中。置37 ℃、5%CO2 和95%空气培养箱中培养，3 d后首次换液，以后每周更换2～3次。 1.2.3 组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞 在超净工作台上，将眼球用PBS冲洗2～3次后沿角膜缘取下完整角膜，放入加有培养液的培养皿中；在体式显微镜下完整撕下角膜上皮面，剪成约1 mm3大小角膜上皮片，均匀平铺于培养瓶中，翻转培养瓶加入全培养液，置培养箱中培养2～4 h后轻轻翻转培养瓶，使培养液慢慢浸过组织块；或将角膜上皮片均匀平铺于24孔板中，置于培养箱中2～4 h，然后缓缓加入全培养液。将培养瓶或24孔板置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，3 d后首次换液，以后每周更换2～3次。 1.2.4 角膜上皮细胞的传代 原代培养至上皮细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 1 ml冲洗1次，再加入消化液1～2 ml，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心6～8 min (1 000 r·min-1)，计数，接种于培养瓶中（按1∶2或1∶3传代），3 d后首次换液，以后每周更换2～3次，直至细胞融合。 1.2.5 观察方法 1.2.5.1 形态观察 每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，拍照记录。 1.2.5.2MTT法测定细胞生长曲线 取生长状态良好的上皮细胞，采用上述传代方法消化，制成细胞悬液，计数，以103 ml-1接种于96孔板，