中药DGH胶囊对自发性糖尿病大鼠玻璃体血管生长因子及视网膜形态学损害的影响实验的研究.pdfVIP

成都中医药大学硕士学位论文 个月病程糖尿病大鼠出现视网膜微血管瘤等糖尿病微血管改变，因此本课题在前期实验 病程糖尿病大鼠视网膜微血管损害及生长因子的影响，以期探讨中药有效部位组合对 DR防治作用及其机制。 2材料与方法 2．1实验材料 2．1．1实验动物 学科学研究所实验动物中心提供。饲养条件保持在室温18～25℃。空气流通，相对湿 颗粒饲料，四川省医学科学研究院实验动物中心提供。 2．1．2实验试剂与药品 lo％福尔马林一PBs缓冲液：四川省人民医院病理科提供。 DGH：成都中医药大学药学院提供。 IGF一1检测试剂盒由美国DSL公司提供． CIV检测试剂盒，一抗购自博士德公司，相应二抗及试剂盒购自Doko公司． 2．1．3主要实验仪器 强生血糖仪 型号：0NEToUcH—II美国强生公司 电子天平 型号：FAll04 上海天平仪器厂 手术显微镜 型号：YE20T 苏州医疗器械厂 Mias2002计算机图像分析仪 四川大学提供 BH-20LY^IPUS光学显微镜． 2．2实验方法 8 成都中医药大学硕士学位论文 2．2．1造摸及分组方法 本实验所采用之GK大鼠为自发性糖尿病动物模型，出生后1．5月血糖开始升高，GK 大鼠是一个评价视网膜微循环的非常有用的动物模型“”。 动物购进后分笼饲养，血糖升高6个月后对用药动物进行重新分组，以SPSS统计软 件产生随机数字对动物进行随机分组。将动物随机分为六组，即阴性对照组、DGH胶囊 低剂量组、DGH胶囊中剂量组、DGH胶囊高剂量组、递法明组和导升明组，各13只动物， 另设有正常对照组10只． 2．2．2给药方法 将以上各组大鼠连续给药3个月，方法如下： 阴性对照组：每天灌胃与中药DGH胶囊中剂量等容的蒸馏水。 量． 剂量． 剂量． 递法明组：每天灌胃50mg／Kg的递法明混悬液，相当于10倍成人剂量． 一 导升明组：每天灌胃200mg／Kg的导升明混悬液，相当于10倍成人剂量。 正常对照组：每天灌胃与中药DGIt胶囊中剂量等容的蒸馏水． 给药时间：每日灌胃一次，连续给药3个月． 每2周称一次体重以调整给药量． 备注：混悬液以药物加入生理盐水中，按平均每只灌胃2M的比例配置。 2．2．3测试指标与方法 2．2．3．1一般状态的观察 包括行为、状态、体征、饮水量、摄食、尿量、大便性状等． 2．2．3．2体重 血糖升高6个月时，即治疗前，称体重一次，治疗后每2周称体重一次。 2．2．3．3血糖 9 成都中医药大学硕士学位论文 方法一葡萄糖氧化酶法：动物禁食12小时，断尾采血约lml于毛细玻管内，立即 送检验室离心后取血清，37℃水浴，751GW紫外分光光度计检测。 方法二强生血糖仪测量(因大鼠尾部溃疡重，为减少采血引起的疮面)，动物禁食 12小时，针头刺破尾静脉采血一滴于罗氏血糖试纸上，立即用强生血糖仪检测，记录 结果。 ● 血糖升高6个月时．即治疗前，测血糖一次，治疗后每月末测一次血糖。 2．2．3．4玻璃体IGF—l检测 物股动脉放血处死，立即取出眼球，修剪后，在显微镜下取出玻璃体分装入5ml离心管内， 立即送检．具体过程如： Buffer ①样本稀释：使用试剂盒中样本稀释缓冲液I(sampleI)140ul／每管．加入 Buffer if)150ul／每管，充分混匀．即30倍稀释． ②操作程序：分别加入各种浓度的标准品，质控品和样本稀释品20ul于每孔．然后 据标准品浓度为x轴，对应测得的0．D为Y轴，做直线回归方程，制出标准曲线．然后从标 准曲线换算得出