CYP1A1基因多态性与p16基因甲基化对肺癌发病的影响.docxVIP

安徽医科大学硕士学住论文ＣＹＰＩＡｌ基因多态性与ｐ１６基因甲基化对肺癌发病的影响１前言肺癌是当今严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计，肺癌以每年０．５％的速度在全球增长。美国每年死于肺癌的人数约占全部癌症死亡数的２８．６％，占全部死因的８％，在我国大中城市肺癌已跃居所有恶性肿瘤之首，发病率占所有恶性肿瘤的２３．６％，死亡率占２０．７％。肺癌是由环境、遗传等多种因素共同作用的结果，但是肺癌的确切病因及发病机理迄今为止尚未真正完全弄清。此研究利用现代环境流行病学和分子遗传学的理论与方法，探讨肺癌易感基因多态性对抑癌基因甲基化的影响，以及肺癌易感基因多态性、抑癌基因表遗传与吸烟等主要环境因素在肺癌发病过程中的交互作用。不仅为从根本上认识和理解肺癌的发病病因及其发病机理提供科学依据，而且对肺癌易感人群的确认，肺癌的早期诊断和有效防治都将具有十分重要的意义。近几年来对于抑癌基因表遗传在肺癌发病中作用的研究取得了突破性进展，有关肺癌的发病与易感基因多态性和吸烟之间关系的研究报道也是层出不穷。所有这些研究都是从易感基因或者抑癌基因的一个方面来探讨肺癌的发病机制，但对于易感基因多态性、抑癌基因表遗传与吸烟等主要环境暴露因素在肺癌发病中的交互作用研究甚少，我们的研究正是基于多因素联合分析基础上，利用现代环境流行病学和分子遗传学的理论与方法，探讨肺癌易感基因多态性对抑癌基因甲基化的影响，以及肺癌易感基因多态性、抑癌基因表遗传与吸烟等主要环境因素在肺癌发病过程中的交互作用。肺癌的发生是环境因素与遗传因素复杂交互作用的结果。与肿瘤易感性相关的基因有两大类，即Ｉ相与Ⅱ相代谢酶基因。外源性致癌物在体内可由Ｉ相代谢酶催化成为终致癌物。也可由ＩＩ相代谢酶降解排出。细胞色素Ｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０，ｃＹＰ）酶是Ｉ相代谢酶，是代谢内、外源性化合物的重要酶系∞】，其编码的芳３安徽医科大学硕士学位论文烃羟化酶（ＡＨＨ）参与致癌物进入体内的第一阶段氧化激活反应，将外源性无活性的前致癌物激活转变为有活性的亲电子化合物，与细胞内的生物大分子ＤＮＡ或蛋白质结合，形成化合物，使ＤＮＡ发生突变，导致某些癌基因的激活或抑癌基因的失活，最终导致癌变。Ｉ相代谢酶ＣＹＰｌＡｌ存在着遗传多态性【３】，它们的产物往往具有不同的生物学活性，从而表现为机体对同一化学致癌物的敏感性不同。ｐ１６基因是１９９４年发现的一个重要的多肿瘤抑制基因（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ１，ＭＴＳｌ）ｔ帖），参与细胞周期的调控，控制细胞生长和分化，其失活机制包括缺失、突变及５’端启动子区域ｃｐＧ岛的甲基化【明。本研究采用病例对照研究，利用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）和甲基化特异性ＰＣＲ（ｒｎｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ，ＭＳＰ）等技术，分析了细胞色素Ｐ４５０１ＡＩ（ＣＹＰｌＡｌ）和ｐ１６基因对肺癌发病的影响，旨在为确定肺癌易感性遗传标记及寻找肺癌早期诊断的分子标记物提供依据。２材料与方法２．１研究对象的选择及标本采集病例组选取安徽医科大学第一附属医院胸外科行外科切除术、并经病理确诊的安徽籍原发性肺癌患者９４例，每位肺癌患者以１：１匹配选取同期两位无呼吸系统疾病又未患任何肿瘤、年龄相差２岁以内且性别相同者，作为对照组，共９４例。采集实验对象的外周静脉血５毫升，ＥＤ．Ｉ－Ａ抗凝，于．２０℃冷藏保存。在患者进行外科手术时收集患者肺肿瘤组织及远离肿瘤部位３厘米以上的癌旁正常组织各ｌ克，分别放入液氮冷藏管中，贴上研究对象唯一专用ＩＤ号标签后，迅速交专人（试验室人员）管理，立即放进液氮罐中保存。运输过程中应采用运输用液氮罐，送实验室转入储存用液氮罐以长期保存。同时采用封闭式调查表问卷调查，收集实验对象的人口学资料、吸烟史、职业史、饮食习惯等。一些指标定义如下：吸烟量＝每日吸烟量（包）×３６５；喝茶指平均每周饮茶７次以上；经常吃咸腌食物、辛辣食物指每周食用次数超过３次；经常、４安徽医科大学硕士学位论文吃水果青菜指每周食用次数超过７次，且每次不少于０．０５ｋｇ；接触粉尘指曾经在矽尘、煤尘等粉尘环境中工作过，时间累计超过６个月；接触有毒物质指曾在有毒化学物质或有害气体的环境中工作过，时间累计超过６个月；高频辐射源指离家半公里范围内有高频辐射源。２．２实验室配备及仪器（１）恒温水浴箱（２）普通离心机（３）冷冻高速离心机（４）冰箱（－８０度，－２０度，４度）（５）液氮罐（储存用３０升及运输用１０升）及液氮（定期更换）（６）玻璃匀浆器（数控１２００转／分）（７）自动制冰机（８）ＰＣＲ仪（９）电泳仪（１０）ＰＨ计（１１）电子天平（１２）凝胶成像系统（ＶＤＳ紫外暗箱，数码摄像机，热敏打印机，视频捕捉卡，电脑，图像分析软件）（１３）恒温摇床（１４）紫外／