PRL-3在人胃癌中表达及其特异性SiRNA在体外干预影响.pdfVIP

福建医科大学2007届硕士研究生论文 前 言 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，虽然随着医学技术的发展，早期胃癌的 手术治疗手段有明显改善，胃癌患者的治愈率及5年生存率有所上升。但是多数患 者确诊时已属晚期，侵袭转移是影响胃癌患者预后的重要原因。现在认为癌症是 一种基因组的疾病，其特征是癌基因的激活和抑癌基因的失活。同样胃癌的转移 也被认为与一系列的基因的出现、突变或者缺失相关，寻找与胃癌发生、转移的 相关基因，揭示其发生机制，从而最终确定治疗靶点是治疗胃癌转移的前提条件。 肝再生磷酸酶一3(PRL．3)是新近发现的一种酪氨酸磷酸酶，相对分子质 量为22×103，是一类分子量最小非典型磷酸酪氨酸蛋白之一，被认为是一种肿 瘤潜在的诊断标记和治疗的靶点。在多种肿瘤中的表达水平高于其相应的正常组 织，特别是结肠癌肝转移的组织中，其表达水平远远高于无转移结肠肿瘤和正常 的结肠上皮。研究表明PRL-3在细胞增殖、迁移、侵袭关系密切，被认为是肿 瘤侵袭转移的靶基因。但是PRL．3与胃癌的生物学特征的关系如何，目前研究 尚不深入。 核苷酸的小干扰RNA(SiRNA)。RNAi基因阻断的有效性和特异性使其可能成为疾 病基因疗法的理想工具。近年来RNA干扰作为一种崭新的实验方法被广泛应用 siRNA)抑制胃癌细胞PRL-3基因表达，则可抑制胃癌的发生、发展，进而为肿 瘤的基因治疗提供新的策略和途径。 本文结构分为两部分：第一部分采用免疫组织化学方法，检测胃癌细胞中 PRL-3蛋白的表达情况，试图揭示PRL一3在人胃癌发生、发展中的作用；第二部 分体外转录合成特异性PRL一3siRNh，利用其对胃癌细胞$6C7901的体外干预， 试图揭示PRL-3的生物学功能，同时为胃癌的治疗提供新的思路和途径。 4 福建医科大学2007届硕士研究生论文 第一章：酪氨酸磷酸酶PRL-3在胃癌组织中的表达 一、材料和方法： 1．材料 1．1标本来源与保存 收集福建医科大学附属协和医院肿瘤科2004年间手术切除且资料完整、诊断 明确的原发性胃癌59例，14例距离肿瘤边缘6cm以上的切缘作为正常对照，患者术 前均未经放疗和化疗，术后病理证实为腺癌，组织学分类明确者，术切除标本组 织块足够大，可以同时满足临床病理诊断和科研需要，临床资料完整，组织块保 存完好。其中男42例，女17例，年龄25～79岁。低分化癌24例，高分化、中分化癌 35例。伴淋巴结转移40例，无淋巴结转移19例。浸润未超过浆膜层(T1+T2)16 Ⅳ期23例。 1．2主要仪器设备及试剂 (1)石蜡切片机Leica，德国 (21WP800型微波炉 格兰仕，中国顺德 Pard (3)隔水恒温孵育箱BlueGHP．9080，中国上海 (4)兔抗人PRL-3抗体Zymed，美国 (5)S-P试剂盒 福州迈新生物技术有限公司 (6)DAB显色试剂盒 福州迈新生物技术有限公司 (7)多聚甲醛 福州迈新生物技术有限公司 (8)多聚赖氨酸 Sigma，美国 1．2组织免疫学检测 1．2．1免疫组织化学是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异性结合及适当的显色 剂，对抗原进行定位及半定量测定的技术。 1．2．2具体操作步骤如下： 1)载玻片经浓硫酸浸泡24h，置于自来水和蒸馏水漂洗干净，600C烤箱烘 干后，稀释的多聚赖氨酸溶液100ul均匀涂在上面，自然晾干待用： 2)标本按常规脱水固定，石蜡包埋，4um连续切片，置入60℃烤箱24h烘 干： 福建医科大学2007届硕士研究生论文 3)石蜡切片脱蜡到水：二甲苯脱蜡，按10005，95％，80％，7005酒精梯度脱 水，自来水充分冲洗，蒸馏水漂洗2次，每次3分钟： 计时，1-2分钟后，离开热源，自然冷却。PBS冲洗2次，每次约3分钟。 5)每张切片加一滴氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育lO分钟，以阻 断内源性过氧化物酶的活性。PBS