阿托伐他汀钙对人脐静脉内皮细胞E-选择素和细胞间粘附分子-1表达影响.pdfVIP

平滑肌细胞、巨噬细胞均表达ICAM．1，其中脂纹病变处表达量最大。 Vander Wal等也发现[103人冠状动脉弥漫增厚处的内皮细胞和粥样斑 块处的内皮细胞、巨噬细胞均表达ICAM．1和E．sel，且在有明显T细 胞和巨噬细胞浸润处附近的内皮细胞也增加了ICAM．1和E．sel的表 KD等…3在研究 达，但在没有炎性细胞浸润的部位则不表达。O’Brien 中还发现，在粥样斑块中的新生血管中ICAM．1和E．sel表达高于其在 动脉腔其他处内皮表达的2倍。在浓度选择方面，本实验所选择在A]N 浓度与临床剂量是相对应的，即实验浓度0．002．0．2uM／L与口服 10-80mg／d对应吲。且因细胞因子诱导血管内皮细胞表达粘附分子， 促进白细胞向内皮细胞滚动、粘附及内皮下移行，在整个动咏粥样硬 化发生、发展过程中起到了关键性的作用，故实验中采取以肿瘤坏死 因子Q(tllmornecrosis vein umbilicalendothelial 内皮细胞(human 以期进一步了解ATV在浓度方面对于HUVEC粘附分子表达的影响。 材料及方法 一．药品与细胞因子溶液的制备 1．药品的配制 将ATV 原液经10倍稀释成1液，1液再经10倍稀释成2液，2液经lO倍稀 释即成3液，以备用。 2．细胞因子的配制 用。 3．细胞培养液的配制 M199培养基、20％FBS(胎牛血清，天津血液病研究所提供)、 ug／rnl、青霉 ECGF20ug／ml(生长因子，瑞士罗氏公司提供)、肝素50 素100u／ml、链霉素100ug／ml、20mM／LHEPES 二．人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定 取健康孕妇所产婴儿的新鲜脐带(由大连医科大学附属一院、二 院及大连市妇产医院产房提供)进行无菌处理，用D．Hank、S液反复冲 洗脐静脉至无血污，后注入O．1％胶原酶(Sigma公司)消化脐静脉内 皮约8．15分钟左右，离心消化液，倒掉上清，加入含20％FBS的M199 培养液吹打细胞团至悬浮，接种予内衬明胶的培养瓶中，置于370C、 5％C02培养箱中培养。每周更换相同培养液2．3次，待细胞长至融合 状态，传代。本实验所用为第2、3代细胞。所培养的内皮细胞(见图 1)形态学符合内皮细胞特征，抗Ⅷ因子抗体(Sigma公司)染色阳性。 三．内皮细胞的分组 生长良好的2代或3代人脐静脉内皮细胞，经0．3％分散用胰酶进 行消化后离心，去上清，再加入上述培养液，吹打至细胞悬浮，以5 M199培养 培养箱中培养。待长至融合状态，再予以更换为含2％FBS 液过夜，次日倒掉培养液，除l孔外，均加入40ng／ml浓度的TNF-Ct， M1 99 培养液将孔内总液量均补至2ml，后置于上述条件下培养24h。 四．RNA的提取 取出6孔板，在每个孔内加入l毫升TRIzoL试剂，反复吹打后， 将液体分别移入新的离心管中，经低温高速离心机120009，40C，离心 lO分钟：后吸上清，各加入0．4ml氯仿充分摇匀，150c，孵育5分钟， 再离心同上；将各管内水相分别移入新离心管，各加入0．5ml异丙醇， 室温下，10分钟，后离心同上；弃上清，加入75％乙醇1m1，震荡混 匀，40C，75009，离心5分钟；再弃上清，于空气中干燥5—10分钟， 经去tL,NA酶水溶解RNA，反复吹打后，于55-60oC，孵育10分钟，分 ·6。 装，于一70oC保存，以备用。 五．半定量逆转录聚合酶链式反应(RT．PCR)