雌激素对去势雌性大鼠子宫nNOS免疫反应阳性神经纤维影响.pdfVIP

山西医科大学硕士学位论文 材料与方法 l实验动物 本实验采用健康未交配3—4月龄，体重200250克的雌性wistar 大鼠50只作为实验对象，动物由山西医科大学动物实验中心提供。动物 用常规饲料喂养，自由饮水。 2试剂 兔抗nNOS血清、封闭用山羊血清、DAB及SABC，试剂盒均由北 京中山生物工程有限公司提供。 3实验方法 3．1动物分组：将50只大鼠随机分为假手术组(sham)，卵巢切除后一 月、二月组(OVXl、OVX2)，卵巢切除后肌注苯甲酸雌二醇一月、二月组 四组均为实验组。sham组大鼠，剖腹找到卵巢后，不摘掉并立即关腹； 余四组大鼠经麻醉后摘除双侧卵巢；ovx+El、ovx+E2组于术后一周隔日 注射苯甲酸雌二醇，50微克／只。 3-2卵巢摘除的模型制作：用3％戊巴比妥钠(1m。∥kg)腹腔麻醉，在肋 弓下1em剪去长毛，取腹部切口开腹，在Y型的子宫末端可见粉红色绿 豆大小的卵巢，将其移出腹腔后结扎，切除双侧卵巢后缝合腹壁。 3．3阴道涂片：每日晨8-9时，对sham组大鼠进行阴道涂片，染色观察 动情周期变化，待出现动情期后作为实验对象。 4实验过程 4．1灌注取材：动物用戊巴比妥钠(50mg／kg)腹腔麻醉后，经左心室～ 升主动脉依次灌注生理盐水300ml，4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液500ml， 10％蔗糖的PBS液200ml，灌注后取子宫入4％多聚甲醛PBS液3小时， 再入20％蔗糖PBS液4℃过夜，直至子宫下沉。 山西医科大学硕士学位论文 4．2冰冻切片：取出下沉的子宫组织，将子宫分为子宫角、子宫体、子宫 颈三部分，垂直于子宫长轴行连续冰冻切片，片厚约40微米，入lmol／L 的磷酸缓冲液(PH7．4)中待染。 4．3免疫组化染色，其流程如下： (1)将各部切片在lmol／LPBS液中漂洗10分钟。 PBS液 (2)用3％H202封闭内源性过氧化物酶30分钟一1小时，1mol／L 中漂洗3次，每次5分钟。 1小时。 (4)将切片分实验组、对照组、空白对照组分别进行实验，实验组、对 照组入兔抗nNOS(浓缩型)血清(1：100)，空白对照组入兔血清 液(1：100PBS)，37℃孵育2—3小时，并置于4。C冰箱过夜后， lmol／L PBS(PH7．4)液中漂洗3次，每次5分钟。 (5)孵育后的切片入由生物素标记的羊抗兔IgG液中(即用型)，37。C 孵育40分钟，lmol／LPBS(PH7．4)液中漂洗3次，每次5分钟。 (6)入链酶卵白素一生物素复合物中，37。C孵育40分钟。lmol／LPBS (PH7．4)液中漂洗3次，每次5分钟。 (7)DAB反应液中呈色。 4．4裱片制片：染色后用lmol／L PBS液(PH7．4)、双蒸水各洗5分钟， 入O．2％明胶裱片液中行分部裱片，风干后行常规梯度酒精脱水，二 甲苯透明并DPX封片。 5选片与计数 于明视野显微镜下，观察nNOS阳性神经纤维，每只动物每个部位各 取一张切片，每张切片计数3处不同部位阳性神经纤维的数目，将各组切 片所测数据进行统计分析。 6统计处理 本数据服从Poisson分布，经平方根变换后，组间比较采用方差分析， 数据均以均数±标准差表示，两两比较采用SNK—q检验，所有计算由统 计分析软件6．12完成，并定义P0．05为显著性界值 山西医科大学硕士学位论文 实验结果 本次实验将子宫分为子宫角、子宫体、子宫颈三部分，实验组和假手 术组大鼠子宫经DAB所染的棕色的nNOs阳性神经纤维里串珠或细丝状，弯 曲走行，多有分支。以子宫颈最多，其次为子宫体、子宫角。在子宫壁上 以环行肌层最多且走行与肌纤维平行，在纵行肌上有时可见呈串珠的纤维， 在雌激素的影响下，nNOS阳性神经纤维表达发生明显的变化。所有空白