影响凯氏定氮法测定粗蛋白准确性应注意的细节问题.docVIP

国标为0.4g硫酸铜和6g无水硫酸钾(或无水硫酸钠)，比例为1:12。若添加量加大，消化液易结块不易转移；添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。 3.2 硫酸的用量浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。对于体积大重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或者含水量较高的试样、淀粉含量多的精料,应适当加大浓硫酸的用量，多为15ml左右。这是由于此类样品，浓硫酸在对其脱水和碳化是消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水和碳化时就会出现烧干现象。反之则需加入10ml左右。若通风柜的排风量较大时应适当多加浓硫酸2ml左右，以防止浓硫酸的蒸发而是其浓度降低，试样消化不完全从而导致所测得的数值偏低。3.3 消化温度刚开始时以低温(200～300℃)加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提高温度(360～410℃)。起初低温加热是为防止试样起泡沫，而溢出烧瓶外或碳化后的颗粒粘附于烧瓶壁，导致消化不完全，所测结果偏低。对于富含脂肪或者在消化过程中易发泡的样品，可在消化前滴加少量消泡剂，如辛醇、液体石蜡等。3.4 消化时间消化时间也是许多文献一直在探讨的问题，也有许多快速消化法的研究。其消化时间的标准为消化呈透明蓝绿色后，加热消化15min。根据苏军等研究表明，消化液澄清后再继续消化30min为宜。此试验只是针对于蛋白含量低于蚕蛹的样品，而对于蛋白含量高于蚕蛹的样品，如进口鱼粉、血粉、羽毛粉等并未进行试验性研究。因此我个人认为，可根据试样的重量、蛋白含量的多少以及消化的难易程度而适当调整消化液澄清后的消化时间。对于所称试样质量较多、蛋白含量高于蚕蛹或者难消化的试样，消化液澄清后继续消化的时间可控制在45min～2h不等，具体时间化验工作者可根据自己的工作经验而自行定夺。3.5 消化液的转移及定容消化结束后，把凯氏烧瓶从电炉上取下，放在小铁筐内冷却。此时一定要注意安全，带稍厚手套防止烫伤。冷却至室温后加入蒸馏水10～20ml，在等冷却至室温后转移到100ml容量瓶内。在转移是为减少损失误差，应在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶和漏斗(即采用少量多次原则)，否则会因偶然误差而导致测定结果偏低。转移完成后不要立即定容，应冷却至室温后再定容。若未冷却而定容，待冷却后，体积缩小，从而使吸取的试样分解液的量偏大，测定结果将偏高。若消化完毕冷却后，消化液不能当天定容需隔夜保存时，应先将凯氏烧瓶内加入少量的蒸馏水，防止消化液结晶，再把凯氏烧瓶口用塑料布包好，防止吸收空气中的氨而影响结果的准确性。消化液若结晶不易转移时，可将凯氏烧瓶放在电炉上加热一下，待结晶融化后再转移。 4 蒸馏4.1 蒸汽发生器内水的体积及酸碱性蒸汽发生器内的水的体积应控制在其容积的2/3左右，并控制液面高度。水的体积过大易在沸腾后从蒸汽发生器中玻璃管中溢出烫伤工作人员；过少易产生的气体压力不足或蒸干蒸汽发生器发生事故。水加入的同时一同加入几滴硫酸和几滴混合指示剂，且保持水一直呈紫红色，以防止水中含有氨态的氮溢出而影响测定值。4.2 蒸馏装置的气密性在蒸馏操作开始前一定要检查一下蒸馏装置的气密性。各导管的接口及用久的橡皮管应重点检查。添加消化液和碱液的玻杯口要拧紧、液封，防止产生的氨气逸出。在检查气密性的同时还应打开冷凝水开关且要保持一定的流速，否则冷却不完全。这是很容易忽视的问题，特别是初学者。4.3 试样分解液的移取要准确在移取试样分解液前先把容量瓶摇匀,把10ml移液管用所以取得试样分解液润洗2～3次后，再进行移取。移取时移液管应垂直于地面，视线与移液管刻度线平行。吸取完试样液后把移液管放到反应室内自然流入反应室，切忌把移液管放到小玻杯内及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸馏水冲洗一下小玻杯，并把棒状玻塞塞紧。4.4 氢氧化钠溶液的加入量在蒸馏过程中，反应室内溶液应保持碱性，碱的加入量一般为10ml左右，若在消化时所加入的硫酸偏多，40%氢氧化钠溶液的量也要随之增加，这样才能保证除用于和硫酸及硫酸铜反应外，还有足以使氨根转化为氨的碱量。加入的碱先放入小玻杯内，慢慢转动棒状玻塞，使碱缓慢流到反应室内，然后再将小玻杯内加入蒸馏水液封，切忌把棒状玻塞提起加碱—特别是初学者，这样会造成反应后生成的氨从玻口逸出，导致所测蛋白含量偏低。4.5 蒸馏速度与气流蒸馏时产生的气流一定要均匀，切忌热力不稳、中途中断或蒸汽不足，否则反应室内温度会降低，易产生倒吸；气流过快硼酸吸收不完全。蒸馏的速度除与气流有关外还与冷却水的流速及电路的温度有关。蒸馏速度快，反应液易被蒸汽带出而使测定结果偏高；蒸馏速度慢，氨没有被完全蒸馏出来而结果偏低。那么以什么样的蒸馏速度为宜呢？据贾艳玲和冷柏忠(2000)实践证明：蒸馏速度一般应控制在每分钟蒸馏出液体