家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母gs115中的-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(11):2189-2198 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.11.007 家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace 在毕赤酵母 GS115 中的表达及其分析 1 1 1 2 3 1 1 1 1 何永盛 ，陈舒迟 ，王 弘 ，韩双艳 ，杨 琼 ，刘细霞 ，董洁娴 ，杨武英 ，孙远明 1 2 （广东省食品质量与安全重点实验室/华南农业大学食品质量与安全研究所，广州 510642； 华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006 ； 3 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州 510610 ） 摘要：【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶（BmAChE）的毕赤酵母菌株，实现BmAChE 在毕赤酵母中分泌表达 并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA，经RT-PCR 反转录成cDNA，通过PCR 扩增出家蚕乙酰胆碱 酯酶基因bmace 并进行序列测定。采用PCR 及重叠延伸PCR 去除原bmace 中的信号肽和疏水肽，并对序列中存在 的2 个A+T 富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace 与表达载体pPIC9K 连接，转化毕赤酵母GS115， 甲醇诱导表达。SDS和Western blotting 鉴定重组蛋白，以Ellman 法测定酶活力，毒扁豆碱和有机磷及氨 基甲酸酯类农药抑制试验分析重组 BmAChE （rBmAChE）的生物活性。 【结果】改造后的bmace 经重组毕赤酵母菌 -1 株分泌表达了1 个分子量约为70 kD 的蛋白，具有AChE 活性，酶比活力约为1 187 U·mg 。抑制试验显示，该rBmAChE 能够被毒扁豆碱强烈抑制，并且可被皮蝇磷等10 种有机磷农药和克百威等5 种氨基甲酸酯类农药抑制，最低抑制 -10 -1 浓度 IC 值可达 2.78×10 mol·L 。 【结论】成功构建分泌表达BmAChE 的毕赤酵母菌株，其表达了具有良好活 50 性的rBmAChE，可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。 关键词：毕赤酵母；重组家蚕乙酰胆碱酯酶；表达；活性分析；有机磷农药；氨基甲酸酯类农药 Expression of Bombyx mori Acetylcholinesterase Gene bmace in Pichia pastoris GS115 and Analysis of Its Bioactivity 1 1 1 2 3 1 HE Yong-sheng , CHEN Shu-chi , WANG Hong , HAN Shuang-yan , YANG Qiong , LIU Xi-xia , 1 1