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单分子荧光检测技术single molecules fluorescence detection 涂熹娟 B200425010 前 言 单分子检测技术 单分子荧光检测技术原理及应用 小 结 前 言 统计力学的各态遍历假设（Ergodic Hypothesis）： 系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均 在包含完全相同个体的系综，测量时间足够长 系综测量和单分子测量结果相同 在均相体系：测量时间可能小于涨落时间 非均相体系：个体轨迹平均不等于系综平均 系综测量和单分子测量结果不等 近代，随着各个学科的发展，科学研究达到了微观分子水平，使得我们可以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应 单分子检测实验的重要性： 对非均相体系，可给出分子性质的分布信息 对均相和非均相体系，单分子轨迹即是分子性质涨落的直接记录，蕴涵丰富的动力学知识 单分子检测技术 扫描探针显微技术 (Scanning Probe Microscopy) 光学和光谱技术 单分子荧光检测原理 单分子荧光检测是单分子检测最常用的方法 标记在生物大分子上各个荧光基团的各种特性的变化反映了有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变的信息 对宿主影响小 稀溶液中荧光发射检测较为灵敏，背景值较低，信噪比高 2.单分子荧光产生原理 3.单分子荧光的特征 量子跳跃特性 发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的主要特征之一，取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光光谱和荧光强度涨落现象的原因 荧光偏振特性 单分子荧光分子具有唯一的固定吸收和发射偶极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以完全确定单个荧光分子的空间取向。这是单分子荧光的主要特征之二 4.单分子荧光探测的技术关键 在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用（调整研究体系的浓度或密度） 确保单分子的信号大于背景干扰信号 (有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰) 5.单分子荧光检测的应用 1.单分子荧光寿命 2.单分子荧光偏振 分子只吸收偏振方向与其跃迁偶极矩方向一致的光子，并发出具有一定偏振方向的荧光 如果固定激发光的偏振方向，对于标记于生物单分子的某一特殊位置的荧光分子，其荧光强度就 会随着生物单分子在生化 反应过程中构象的涨落 （旋转、扩散）的变化而 变化 3.单分子荧光共振能量转移 荧光共振能量转移原理 当能量给体分子（D）和受体分子(A)相隔的距离远大于D –A碰撞直径时，如若D的发射谱与A的吸收光谱发生重叠，且距离在有效范围内，能量就可以从短波长的荧光基团D传递到长波长的荧光基团A，这个过程称为荧光共振能量转移，实际相当于将短波长荧光基团D释放的荧光屏蔽 这是一种通 过偶极－偶极耦 合作用的能量转 移过程。 单分子荧光共振能量转移即是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团，作为能量的供体和受体 通过检测能量在供、给体之间的转移效率，可确定两点间距离的变化。依据其距离变化随时间的改变关系则可推测生物大分子在生命活动中（e.g.催化，折叠）构象变化的所引起的两点间距离的变化，得到动力学过程 小 结 单分子荧光检测可提供有别于分子聚积态的单个分子的特殊局域环境、分子涨落、生物大分子的柔性及其运动等有价值的信息 该技术在实现和应用上投入相对较少 * * 光学显微镜 电子显微镜 扫描隧道显微镜 扫描探针显微技术和光学技术连用 显微镜的发展 扫描隧道显微技术（STM） 原子力显微技术(AFM) 扫描离子电导显微技术(SICM) 光钳技术(Optical Tweezer) 荧光技术(Fluorescence) 扫描近场光学显微技术（SNOM） T1 h?A h?A Absorption 10-15 s Vibrational relax, VR, 10-12?10-14 s Internal conversion, IC, 10-11?10-13 s Intersystem crossing, ISC, 10-2?10-6 s Fluorescence Phosphoresce