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慢病毒探究进展和其在肝病治疗中应用 　　【摘 要】肝脏是人体维持生命活动的重要器官。肝炎、肝纤维化等疾病严重危害人体健康。目前多种肝病缺乏彻底治愈的特效药物，治疗难度较大。随着生物技术的发展，基因治疗已经成为疾病治疗的新焦点。慢病毒载体具有多种优点，广泛应用于基因治疗。本文就慢病毒载体的生物学特征以及在肝病治疗中的应用等方面作一简介。 【关键词】肝病；慢病毒 【中图分类号】R346 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）06-0084-02 肝脏是维持生命活动的一个必不可少的重要器官，是人体内最大的消化腺，体内物质能量代谢的中心站。常见的肝病有肝炎、肝脓肿、肝硬化、原发性肝癌等。肝炎、肝纤维化和肝癌严重威胁人类健康，是常见肝病发展的“三部曲”。中国是名副其实的“肝病大国”，治疗肝病三种原则分别是抗病毒，提高免疫力，恢复肝功能。多种肝病治疗的难度较大，诊疗过程漫长，目前尚无彻底的一次性治愈的特效药物问世。 随着生物技术的发展以及对疾病分子机制认识的加深，基因治疗已成为治疗肿瘤及多种疾病的新焦点[1]。基因治疗是向靶细胞中引入外源DNA 或RNA 片段，以补偿基因缺陷或抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。 理想的基因载体应既缺乏自身复制能力，安全无害，又具有稳定的靶向性。基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆腺相关病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、转录病毒载体、痘苗病毒载体等[2]。相比其他病毒载体，慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有免疫反应小、容纳外源性目的基因片段大等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。本文将就慢病毒载体的生物学特征、研究进展以及在肝病治疗中的应用等方面进行总结。 1 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制 3 种分子元件决定了慢病毒载体转导非分裂期细胞的能力：MAN、IN 和vpr。这3 类蛋白利用细胞核的输入机制，靶向作用于细胞核的前整合复合物（ PIC）。细胞核的输入系统包括： 胞质蛋白、importin2a 、importin2b 及核孔蛋白。importin2a 含有一个细胞定位序列（NLS） 的结合位点，当含有NLS的蛋白与importin2a 结合在一起，发生构象变化，与importin2b 相互作用，然后importin2b 通过与核孔蛋白结合，靶向作用于核孔复合物。实际构建时，vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。 慢病毒载体不仅可以用于基因过表达，也可用于基因敲除。 最早有关慢病毒介导RNA干扰的报道发表于2003年。此后的研究证明，慢病毒介导的RNA干扰具有稳定、高效、特异性强的特点；能在哺乳动物各类细胞中实现稳定的RNA干扰[3]。该技术在疾病的基因治疗上具有良好的前景。 2 慢病毒载体的发展 慢病毒载体是慢病毒经过改造而成，改造的目的主要是增加外源基因的表达效率以及提高生物安全性。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。 慢病毒载体系统主要由包装部分和载体部分组成。包装成分提供生产病毒颗粒所必需的蛋白质；载体成分则包括了将在宿主细胞内表达的目的基因。将包装成分和载体成分共转染细胞，即可从细胞上清液中收获携带目的基因、具有感染能力、无复制能力慢病毒载体颗粒。该病毒颗粒既避免了细胞毒性，又保留了高效感染特性。 2.1 第一代慢病毒载体 第一代载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。载体质粒携带了全部5’端非翻译区域和5’端LTR，还带3’端LTR以及rev应答元件。其瞬时表达盒采用巨细胞病毒（CMV） 启动子及增强子件。包装质粒由HIV21前病毒基因组简单修改得到，5’端LTR被异源病毒启动子/ 增强子元件取代。为防止辅助质粒的RNA衣壳化，其5’端主要剪接供体位点（splice donor site）和gag编码序列起始端之间的包装信号区（ E/ Ψregion）被删除，下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号（poly A）取代。 rev虽仍然保留，但被点突变打断env编码序列。辅助结构能表达包括tat及rev（env除外）的所有病毒蛋白。env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。 该系统引入了VSV2G基因表达包膜结构，这样做既使HIV 载体感染宿主的范围扩大到几乎所有组织来源的细胞，又进一步降低了HIV21载体恢复成野生型病毒的可能，同时，这样的改进使HIV载体颗粒具有高度稳定性，能够通过超速离心而浓缩达到高滴度。第一代慢病毒系统是HIV载体系统走向应用迈出的一大步。 2.2 第二代慢病毒载体 第一代载体产生RCR的几率极小，仍然不能排除产生的可能性。1997年，