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《染色体工程》 染色体工程的发展经历 天然染色体片段（如染色体介导的基因转移） 天然染色质片段（如染色质介导的基因转移） DNA重组技术产物-人工染色体 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC） 哺乳类人工染色体（MAC） 染色体是基因的天然载体。这个载体上，目的基因与他两侧的基因或序列是天然的遗传连锁，这种天然的片段进入受体细胞后，可以长时间存在，对目的基因有强大的保护作用。 提高染色体工程的关键技术是把着丝点分离与克隆、然后与目的基因重组，并与组蛋白合成一个染色体片段。 一、染色体介导的基因转移 McBride和Ozer第一次令人信服地证明纯化的染色体片段是对真核细胞进行基因转移的理想的和天然的载体。 受体细胞通常缺乏某一基因的正常功能 供体细胞的同源染色体则具有该基因的正常功能 已使用的基因有：HPRT、嘧啶激酶基因、乳糖激酶基因、抗甲氨蝶呤（MTX）基因、抗鹅膏覃碱基因 1、染色体的分离技术 1、染色体的分离技术 哺乳动物细胞培养 秋水仙碱处理细胞使其处于分裂中期 低渗处理，加皂苷，破裂细胞 TMS液处理，离心，收集染色体 染色体储存于含20％甘油的TM液中 2、染色体转移技术 染色体悬液与受体细胞混合 生长于非选择培养基中持续3代，加多聚L鸟氨酸可提高染色体进入受体细胞的几率 约3天后移入选择培养基 筛选与鉴定 3、被转移染色体片段的大小 大约15％的染色体受体细胞，在光学显微镜下可见到各种大小的染色体片段。光学显微镜下见到的最小染色体片段是双微体（1000kb）。 染色体介导的基因转移的主要作用 一是用于染色体内的基因作图 二是用于分离或克隆一些特殊的基因 虽然DNA序列分析技术和基因克隆技术高度发展的后基因组时代以上用途显得无用，但染色体片段作为真核细胞基因的天然载体，仍是诱人的课题。 二、染色质介导的基因转移 染色质作为转基因载体的提出 染色体介导基因转移由于不能控制所转基因的染色体或染色体片段的种类、数目和大小，故不能有选择的转移目的基因。 1986年李振刚等提出了以染色质为介导的基因转移的工作。用活性模板染色质来转移预期基因（基因群），从而弥补了基因工程的不足。 与DNA相比，染色质是一种更为天然和稳定的转基因载体，便于整合，是基因打靶的理想载体。 活性染色质作为基因载体的特点 染色质工程能选择性的转移基因，并可在不知道目的基因序列或其探针的情况下进行。且可获得一个复杂系统的全部活性基因，可对所有活性基因进行克隆（如YAC克隆，λ克隆等）。 活性染色质作为基因载体的鉴定 基因的鉴定： 用已知基因的染色质片段进行共制备 用所得的活性染色质DNA与家蚕染色质进行染色体原位杂交 三、人工染色体 染色体作为基因转移的天然载体，可转移连锁的基因群，故在此基础上发展了人工染色体。 人工染色体（artificial chromosome）指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。 人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。 现正在研究的人工染色体有： *酵母人工染色体（YAC，1000kb） *细菌人工染色体（BAC，300kb） *哺乳类人工染色体（MAC） P1派生人工染色体（PAC ） 人类游离人工染色体（HAEC）。 完整的染色体DNA的提取 基因组DNA酶切大片段的获取 YAC载体臂的制备 YAC臂与目的DNA大片段的连接 YAC基因库的保存 YAC基因库的鉴定 目的基因YAC克隆的筛选 目的基因YAC克隆的鉴定 YAC的缺点： 1.插入片段大，稳定性较差，不易操作 2.插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 3.YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离时难与天然染色体分开 4.文库中的嵌合现象严重 5.因插入片段大。往往发生序列重排，造成序列错乱。 四、细菌人工染色体（BAC） 1992年Shizuya利用F因子的复制点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。 BAC是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高容量的人工载体。（可克隆350kb，在重组缺陷型（REC—）宿主菌只有1个拷贝） F因子又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中，并能高频率的转移遗传标记。因低拷贝特性使其重排和嵌合程度低。且F因子呈闭环结构，可以用常规技术从大肠杆菌中分离。 1、BAC载体的结构 新一代BAC载体