宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系的建立与优化.pdfVIP

江苏农业科学 2011年第39卷第5期 一 41一 思彬彬，赵海燕，热汗姑 ·阿布都．宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系的建立-9优化[J]．江苏农业科学，2011，39(5)：41—43 宁夏枸杞 ISSR—PCR反应体系的建立与优化 思彬彬，赵海燕，热汗姑 ·阿布都 (北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021) 摘要：采用正交试验和单因子梯度优化相结合的方法，建立和优化枸杞稳定的ISSR—PCR的反应体系和扩增程 序。结果表明，适用于枸杞的25IxLISSR—PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs0．25mmol／L，Mg 2．0mmol／L，引物0．4i~mol／L，模板DNA50ng，Taq酶 1．0U。对于枸杞 ISSR—PCR试验，一次正交试验完全可以建 立满足要求的PCR体系。 ． 关键词i枸杞 ；ISSR—PCR；正交设计；单因子 中图分类号：$567．19 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2011)05—0041—03 枸杞(LyciumbarbarumL．)属茄科多年生落叶灌木，是我 应体系，除表中变化因素外，每管中还含有2．5 10×PCR 国传统名贵中药材。近代医学研究表明，枸杞具有增强免疫 Buffer，引物选用813，PCR扩增程序为：94℃预变性5rain； 力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药理作用…。枸杞主 94℃变性45S，退火9OS，72℃延伸90S，41个循环；72oC延 要分布在宁夏、内蒙古等地的干旱和半干旱地区，虽然枸杞在 伸7rain，4oC保存。扩增反应结束后，PCR产物在 1．2％琼脂 国内已被许多省区引种 ，但是成品枸杞仍以宁夏枸杞最为道 糖凝胶上电泳 ，凝胶中含0．05％的溴化乙锭，电极缓冲液为 1 地 ，其果实被誉为 “红宝”而驰名中外。 ×TAE，电压5V／cm电泳结束后在凝胶成像分析仪上观测分 iSSR(inter—simplesequencerepeat)分子标记是 Zietk— 析并照相。 iewicz等 于1994年创建 ，是基于微卫星技术发展起来的一 表 1 宁夏枸杞 ISSR—PCR反应体系L16(4)正交试验因素水平 种新型分子标记技术，具有多态性高、稳定性好、产物特异性 强等特点 ，目前被广泛应用于植物的品种鉴定、基因定位、 遗传作图、分类与进化等诸多领域 。运用 ISSR标记技 术时，不同的反应体系可产生不同的结果，为了确保 ISSR分 析结果的可靠性和重复性，进行ISSR—PCR反应体系的优化 非常必要。本研究采用正交和单因素相结合试验设计 ，建立 枸杞ISSR—PCR最佳反应体系，旨在为今后枸杞遗传多样 性、亲缘关系、种源鉴定、优良性状标记等研究奠定基础。 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 试验所用材料为宁杞 I号，采自北方民族大学试验基地。 ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列，由上 海生物工程公司合成。PCR反应相关试剂购 自大连宝生物 工程有限公司，PCR反应在 GeneAmpPCRsystem9700PCR 仪上进行。 1．2 方法 1．2．1 基因组 DNA的提取 以枸杞叶片为材料，采用改良 CTAB法提取。用 1．O％琼脂糖电泳和核酸检测仪检测DNA 质量浓度，并稀释至50ng／’ ，一20℃保存。 1．2．3 ISSR—PCR反应体系单因子试验 依据正交试验结 1．2．2 ISSR—PCR反应体系正交试验设计 采用L (4)正 果，选择扩增效果较好的反应体系，在此基础上进行单因素试 交试验设计，对dNTPs、Mg“、引物、模板DNA和Taq酶进行5 验 ，进一步优化影响扩增效果的因素。其中dNTPs浓度设置 因素4水平筛选(表 1)。根据表．1制备总体积为25 的反 0