家兔体细胞核移植技术克隆的研究进展.docVIP

精品论文 参考文献 家兔体细胞核移植技术克隆的研究进展 1.西安医学院外科学教研室；2.西安医学院病理学教研室 【摘 要】体细胞核移植这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，他的成功表明动物体细胞的分化是可逆的。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。然而核重构等核移植基础理论方面的研究还很薄弱，核移植技术还不很完善，克隆动物还存在着成功率较低等问题，在一定程度上限制了它的发展。根据近几年的研究进展，对体细胞核移植技术克隆兔子的方法、应用以及存在的问题作一综述。 【关键词】家兔；体细胞核移植；克隆 核移植（nuclear transplantation，NT）就是将动物早期胚胎卵裂球或动物体细胞的细胞核移植到去核的（同种或异种）受精卵或成熟的卵母细胞质中，从而获得重构卵，并使其恢复细胞分裂，继续发育为与供体细胞基因型完全相同的后代的技术。核移植技术最早是为了研究细胞核的全能性和发育过程中细胞核与细胞质的相互关系而建立的，由德国胚胎学家Spemann 于1938 年首次提出，研究工作主要集中在两栖类和鱼类。随着胚胎工程技术的不断进步，以胚胎细胞作为核供体，先后培育出了克隆羊、小鼠、猪、牛和兔等。1997 年英国罗斯林研究所Wilmut 等[1]首次报道了以成体绵羊乳腺上皮细胞为核供体的克隆羊“Dolly”的诞生，在全世界掀起了轩然大波， 证明了高度分化的体细胞仍具有全能性，已成为生物学发展史上一个重要的里程碑。自此各国科学家相继以体细胞为核供体培育出了克隆小鼠、牛、山羊、猪等。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等利用卵丘细胞为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的研究应用提供了方法。2006年我国学者李善刚博士成功利用体细胞核移植技术从成纤维细胞生产出克隆兔子[2]，之后又将体细胞核移植技术与转基因技术结合起来生产出表达绿色荧光蛋白的克隆兔子，将该项技术推向新的高度。 1 　体细胞核移植的主要方法 具体来讲，核移植技术主要包括以下几个步骤： 1.1 　受体细胞的选择与去核 MII 期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体，只是各个实验室所采用的激活时间有所不同———移核前激活、移核时激活、移核后延迟激活，无论是早期胚胎卵裂球、ES 细胞，还是体细胞的核移植到这类受体中均获得了后代。卵母细胞去核主要有机械去核和化学去核两种方法[3]。 1.2 　供体细胞的选择与移植 目前用于核供体的主要有卵丘细胞、睾丸支柱细胞、精子细胞、脑细胞、胎儿或成体成纤维细胞、乳腺细胞、胚胎干细胞（ES 细胞）等。用于体细胞核移植核供体细胞主要有两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。供体与受体细胞的细胞周期发育同步化是影响核移植成败的一个重要因素，早期的研究认为供体细胞处于G0期[4]是体细胞核移植成功所必需的，并指出可通过选择细胞类型或人工诱导两种方法来获得G0 期细胞。然而近来发现未经休眠诱导的G1 或G2 甚至M期供体细胞的核移植也均获得了成功[5]。 与此同时，研究还发现在小鼠的核移植中供体细胞的类型和基因型对移植效率也有较大影响[6]。供体核的移植主要有融合和注射两种方法。 1.3 　卵母细胞的激活 以成熟卵母细胞为受体的核移植过程中缺少了受精这一步骤，故必须对卵母细胞进行人工激活以促使其进一步发育。目前应用较多的激活方法有电激活、乙醇、离子霉素、钙离子载体A23187、氯化锶、三磷酯酰肌醇（IP3）、精子提取物等[3]。 2 　核移植技术的应用前景 作为生物学发展史上最伟大的成就之一，核移植技术特别是体细胞核移植技术具有十分广阔的应用前景，随着该技术的不断完善必将带来生物学、医学的一场革命，其在畜牧业、物种保护、医疗卫生等领域有着不可估量的作用[7，8，9]。 3 　存在的问题 自1997 年首次报道体细胞核移植成功，数年来研究取得了一定的进展，但仍没有重大突破。核移植成功率较低（lt; 3 %），即使是出生的个体也经常出现一些异常[10]。研究发现，在以卵丘细胞为供体的核移植小鼠胚胎中，90 %的胚胎均具有正常的染色体结构，基因组是正常的，故推测大部分的克隆胚胎异常都是由于错误的表观遗传重构（epigenetic reprogram）造成的[11]。近年来，越来越多的实验证明了这一理论[12]。错误的表观遗传重构主要表现在以下几个方面：DNA 甲基化，基因印迹，X染色体失活，端粒与端粒