烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究.docVIP

烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究 758 两南农业 SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences 2007年20卷4期 V0L20No,4 文章编号:1001-4829(2007)04—0758—04 烟草芜菁花叶病毒的ELISA和 RT.PCR快速检测技术研究 周利飞,刘映红’,孙现超,申艳芝 (西南大学植物保护学院,重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室,重庆400716) 摘要:采用间接ELISA和RT.PCR,建立了烟草芜菁花叶病毒(nl丌lmosa/ev/ms,TuMV)快速检测的技术体系.间接ELISA测 定结果表明,TuMV多抗按1:3000浓度稀释后,具有较高的检测灵敏度,其检测极限浓度为1:3215;通过改进RNA提取技术,从少 量的烟草病叶中提取出高质量总RNA,进行eDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约986bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的 大小一致,可有效地对田间烟株进行快速检测. 关键词:芜菁花叶病毒;间接EUsA;RT-PCR;快速检测 中圈分类号:$572文献标识码:A StudiesontechniquesofrapiddetectingTurn//,MosaicVirus ininfectingtobaccowithELISAandRT-PCR ZHOULi-fei.LIUYing-hong’,SHUNXian-ehao,SHENYah-zhi (ChongqingKeyLaboratoryofEntomologyandPestControlEnnetting,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China) Abstract:IndirectELISAandRT—PCRtechniqueweIeestablishedfortheRAPDdetectionofTurnipmosaicvirusinfectingtobacco.There. suitofindirectELISAshowthattheoptimumworkingconcentrationofpolyelonalantibodyofTuMVWaSdilutedin1:3,000,thecriticalde- tectionconcentrationwa81:3215.TheintegratedandpureRNAwa8obtainedhDmabitofiff~tedtobaccoleaves.Theexpectedsize986bp W88amplifiedbyPCRfromthe~verscproduct.whilenoamplifiedproductsweIeobtainedfromthehealthytissuesamples. Keywords:turnipmosaicvirus;indirectELISA;RT-PCR;rapiddetection 烟草是重庆的重要经济作物之一,近年来烟草 花叶病毒病在重庆发生普遍,且有逐年加重的趋势, 在各烟区发生率为3O%～4O%,个别地区5O%以 上,导致烟叶的产量和质量下降,严重制约重庆烟区 的烟叶生产.2005年青玲等首次报道TuMV在田 间侵染烟草…,且与TMV,CMV,PVY侵染烟草的花 叶症状难以区分,因而准确有效快速检测烟田 TuMV感染的烟草病株对制订防治措施具有重要意 义. 芜菁花叶病毒(rurn~mosaicvirus,TuMV)属马 铃薯Y病毒科(Potyvifidae)马铃薯Y病毒属(P0 v/msY),主要侵染十字花科作物,茄科作物也在其 寄主范围之内】.本研究采用以抗原——抗体特 异性结合为基础的ELISA方法和反转录一聚合酶 收稿日期:2006—12—22 基金项目:重庆市烟草公司项目 作者简介:周利飞(1982一),男,在读硕士,专业方向:农业昆虫 及害虫综合防治,?为通讯作者. 链式反应——RT—PCR技术,建立一套快速,准确的 检测方法,可应用于田间烟草芜菁花叶病毒的快速 检测,鉴定. l材料与方法 1.1材料 2006年6月从重庆武隆采回的烟草病株.采 样时取病株嫩叶,置于冰盒内带回,保存于-80~C超 低温冰箱中.芜菁花叶病毒(TuMV)多克隆抗体购 自浙江大学生物研究所;碱性磷酸酶标记的马抗小 鼠IgG(H+L)购自ZSGB—BIO公司;反转录试剂盒 RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit购自 Fermentas公司;Taq酶购自Takara公司.从感病烟 叶进行ELISA和RT—PCR检测,同时以室内培养的 健康烟苗作为阴性对照. 1.2方法 1.2.1间接ELISA检测技术称取1g烟叶样品 于