β-雌二醇对雌激素受体阳性甲状腺乳头状癌细胞CyclinD1的影响.docVIP

精品论文 参考文献 β-雌二醇对雌激素受体阳性甲状腺乳头状癌细胞CyclinD1的影响 何其勇 国麟祺 夏伟滨 曲义坤 刘伟新(佳木斯大学附属第一医院普外二科黑龙江佳木斯154003) 【摘要】目的：探讨beta;-雌二醇(beta;-E2)对雌激素受体（ER）阳性的甲状腺乳头状癌（PTC）细胞中CyclinD1表达的影响。方法：采用原代细胞培养获得PTC细胞，以10-8mol/Lbeta;-E2作用，分别应用RT-PCR法及Western-bolt法测定CyclinD1的表达。结果：beta;-E2可使PTC细胞中CyclinD1表达增高（Plt;0.05）。结论：beta;-E2可促使PTC细胞中CyclinD1表达增高。 【关键词】beta;-雌二醇;雌激素受体；甲状腺乳头状癌细胞 【中图分类号】R581【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0031-02 CyclinD1在细胞中的过表达和错误调控均可导致细胞周期调控异常，从而发生肿瘤[1]，据文献报道，PTC细胞中ER及CyclinD1阳性率明显高于正常甲状腺组织[2]，本研究立足于E2-ER通路考虑E2可能通过于ER结合，介导某些直接、间接机制促进CyclinD1过度表达，从而促进甲状腺癌发生、发展。对此进行初步探讨。 1方法 1.1甲状腺癌细胞培养：标本取自临床，肿块离体后即刻切取所需标本。冰冻切片证实为甲状腺乳头状癌，手术后标本经石蜡切片证实。标本在手术切取后30min内剪切后消化60-90min，吹打成细胞悬液。过滤，离心，种植后孵育，生长融合至80-90%时进行传代。平均5-7d传代一次，至第三、四代用于实验。 1.2RT-PCR测定ERalpha; mRNA：灭活相关器具RNA酶，并将所有器具高压灭菌，将培养的甲状腺癌细胞离心后得到细胞沉淀。经振荡移出上层水相，再次离心，取出管底沉淀，离心后加入无RNA酶水溶解。经分光光度计检测RNA纯度与含量。将已合成的引物严格按照步骤进行逆转录反应，然后经PCR反应后，以凝胶图像分析系统进行琼脂糖凝胶电泳，将测定后ERmRNA阳性的甲状腺癌细胞归类进行下步实验。 1.3RT-PCR测定甲状腺癌细胞CyclinDl mRNA表达：将实验细胞分成对照组及实验组，分别应用事先合成的引物进行PCR实验，并将电泳产物用成像系统扫描并分析。 1.4Western-blot法测定CyclinD1蛋白的表达：实验分组同前，???严格按照步骤对两组进行Western-blot实验，并将所得结果保存。 1.5统计学处理：采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，两组间比较采用t检验。以Plt;0.05为差别有统计学意义。 2结果 2.1甲状腺癌原代细胞培养：甲状腺癌原代细胞生长情况良好，用胶原酶和胰酶消化后无明显杂细胞如成纤维细胞等。 2.2ER表达:RT-PCR的方法进行ERalpha;定性测定，12例甲状腺乳头状癌中8例ERalpha; mRNA表达增强 2.3RT-PCR法测定CyclinD1 mRNA结果:RT-PCR实验可见于200bp处，雌二醇组CyclinD1表达开始增高，应用光密度分析仪计算雌二醇组CyclinD1 mRNA与beta;-actin mRNA光密度（A）比值，与对照组比较有所升高（Plt;0.05），结果显示雌二醇组CyclinD1 mRNA的表达水平明显升高，并于8h开始接近高峰，8h和12h升高情况明显高于2h和4h。 2.4Western-bolt法测定CyclinD1结果:Western-blot实验可见两组在beta;-actin表达一致的条件下雌二醇组与对照组相比表达增强，应用光密度分析仪计算雌二醇组CyclinD1与beta;-actin光密度（A）比值，与对照组比较有升高（Plt;0.05），结果显示雌二醇组CyclinD1的表达水平明显升高。从而验证了RT-PCR结果。 3讨论 临床上甲状腺肿瘤男女发病率约为1∶4[3]，有研究表明这种现象是由于甲状腺-卵巢-垂体关联系统所决定[4]，近年来，随着ER在多种肿瘤组织中相继检出，甲状腺癌和性激素受体内在联系引人注目[5]。多项研究均提示了雌激素在甲状腺肿瘤的发生中起着相当的作用[6]。而在甲状腺癌组织中检测到ER的蛋白和mRNA进一步支持这样的理论。 CyclinD1被证实是原癌基因，其过表达和错