带状疱疹患儿外周血单个核细胞Toll样受体2.9mRNA的表达.docVIP

精品论文 参考文献 带状疱疹患儿外周血单个核细胞Toll样受体2.9mRNA的表达 张更建1 罗显华2 董泽令2 张信江1 董生凤3 （1遵义医学院附属医院皮肤科 贵州遵义 563003；2遵义医学院附属医院皮肤科化验室 贵州遵义 563003) (3遵义医学院附属医院妇产科 贵州遵义 563003） 【中图分类号】R752.1+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）27-0020-02 【摘要】目的 通过检测带状疱疹患儿外周血单个核细胞（PBMCs）Toll样受体2.9（TLR2.9）mRNA的表达变化，探讨TLR2和 TLR9在儿童带状疱疹发病中的作用。方法 采用实时定量PCR方法检测带状疱疹患儿、成人各10例PBMCs上TLR2、9mRNA的表达水平，并与10例正常儿童作对照。结果 ①带状疱疹患儿PBMC上TLR2.9mRNA表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；②带状疱疹患儿PBMC上TLR2mRNA表达水平高于成人患者，差异有统计学意义(P＜0.05)；带状疱疹患儿PBMC上TLR9mRNA表达水平与成人患者差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 TLR2.9mRNA可能参与了患儿机体对水痘-带状疱疹病毒的的识别及抗病毒免疫，带状疱疹患儿TLR2mRNA的表达水平高于成人，可能是儿童带状疱疹发病低于成人的原因之一。 【关键词】带状疱疹 病毒 Toll样受体 带状疱疹（herpes zoster,HZ）是由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）引起，免疫力低下的人群初次感染此病毒后，临床表现为水痘或隐匿性感染，此后病毒长期潜伏在脊髓后根神经节的神经元中。当机体抵抗力下降时，病毒再次被激活，生长繁殖，诱发免疫应答而发生HZ[1]。 Toll样受体（TLRs）是新近发现的天然免疫模式识别受体，该受体可作为功能受体参与对病原微生物的识别和跨膜信号转导过程，既引起天然免疫,又能进一步启动获得性免疫，在机体的抗感染免疫中具有重要意义[2]。为探讨 TLR2.9在带状疱疹患儿发病机制中的作用，笔者采用实时定量荧光PCR（RT-PCR）技术，检测HZ患儿、成年患者及正常儿童外周血单个核细胞（PBMC）上的 TLR2.TLR9 mRNA的表达情况，以在天然免疫角度探讨HZ的发病机制。 1 资料和方法 1.1 研究对象 10例带状疱疹患儿、10例成年患者均为2009年10月至2010年4月在遵义医学院附属医院皮肤科就诊患者，男女各5例，均符合HZ诊断标准，并排除了内科疾病。所有患者均为发作期，4周内无细菌、病毒、真菌感染史，未曾使用免疫调节药物。患儿组年龄3～12岁，平均5.7岁；成年组年龄17～48岁，平均33.6岁。发病部位分别为眼部、胸背部、上肢。对照组为遵义医学院附属医院儿保科体检者，男女各5例，年龄3～12岁，平均6.4岁，1个月内无细菌、真菌及病毒感染，未曾使用免疫调节剂。 1.2 引物、试剂及仪器 TLR2.9及beta;-actin引物由大连TakaRa生物工程公司合成，引物序列见表1。淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司，总RNA提取液Trizol购于美国gibco公司，RT-PCR所用酶及反应试剂盒购于大连TakaRa生物工程公司。实时荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公司生产，凝胶成像图像分析仪为美国Syngene公司生产，紫外分光光度计为美国Beckman公司生产。 表 1 TLR2,TLR9和 2actin引物信息 1.3 方法 1.3.1 外周血单个核细胞（PBMCs）分离纯化 抽取外周静脉血4ml，以1ml肝素抗凝，加入等量的1640液，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，重悬在含10%胎牛血清的完全RPMI 1640中,置－800C冰箱保存。 1.3.2 细胞总RNA制备及逆转录cDNA 采用Trizol一步法总RNA提取试剂盒提取外周血单个核细胞内总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度及纯度，筛选OD260/OD280(R比值)比值为1.8～2.0之间的样品，计算每份样品的浓度，配制50ng/mu;l RNA样品标准液，每份标本取适量RNAiso Rregent，并按试剂盒说明操作合成cDNA,置－20℃冰箱保存。 1.3.3 实时定量PCR 分别选择目的基因 TLR2,TLR9作为标准品建立标准曲线,得到样品中相应目的基因的拷贝数;同时以管家基因beta;-actin作为内参建立标准曲线,得到样品中管家基因的 拷贝数,将目的基因的拷贝数用