BDNF对星形胶质细胞的作用及ERK信号转导的影响.pdfVIP

BⅨ盯对星形胶质细胞的作用及ERK信号转导的影响 蒋常文 陈森洲奉鸿文周思 夏春波 广酒壮族囱湔区挂抟躐学院人体解剡学教研盘，广溺挂抟54l004 关键调；麟础暇学；麟源性神蛏鬻莽阏予； 攥彤胶餍绷胞；缃胞外播弩调麓激酶 黧形胶矮细胞对神经细魏薅燕婴的交持、翡莽作用，巍神经揽伤修复过程中发挥蘧娶作J!lj。脑源性神 经营葬因子(kai|l_d确ved n朗瑚姻啪ic￡撇of，B瓒旺)邈神经营养阏子家族的重要成熨。研究表明瑚)套iF 时神经细胞的存旗、分化及神经掰生等方面起燕噩作用￡“羽。惬BⅨ旺对摄形狡膜细胞的增髓的影响尚塞见 义黻报道．其储号转导途镪也_求宠全明y。为此，率凌验时BDjNF对星形胶质细胞的作用股纳胞辩储号调 节激瓣(麟细∞uuIaf signa重．捌叫a憾dIciIla鸵，ERX)储号转导进行醋究。 l材料与方法 1．1材料 生膝2～3d SD大暾溺河l匕暾科犬学熨验动物巾心提供，姗泰d俘12培荐撼、PIⅪ8059购良Si舯a公司， 胎}弘觑游购翔天津颥洋生物公蠲，p—H汰小鼠啦觅凝抗体、m，攀抗鼠=抗为S翘taCn勰产品。 1．2方法 l。2．1细胞的分离与培养 蜜骏餍新生2—3dSD大鼠。无蒲条摊下驭黼。纛Hanlcs液中袭除脑膜和斑镣．切取犬麟皮质，放入籁 蠢O．125％瞵酶和0．02％乙三黻阴乙醴(eda躐摊lil：ed确cacid罩DTA)消化液巾，窳澈消化20扣咖。将脑组织移 min。 繁离心镑中，反艇姨打，制_|j蓖缎脆悬液．匀BDMEM摩12培养液巾Il：洧化，75l堋n辩嗣避滤，8∞r舾in离心5 min，然盾翻转培养瓶，通过整速 虫睬上清．用D1旧孙重墨12培养液煎悬纲腿，将绷艴移歪堵养瓶中静谶20 贴蠛的方法波除成纤维翔胞，将细胞悬搬移楚经多鬻赖鳃酸处理的嫱莽瓶中，。鼹37℃、5％c02焙漭簇 DMEM愿12培养液培莽。培养激古lO％胎警斑清、诲霉索100U／雠、链霉索looU姻畦。3—4d换培养滚一次， 细胞接近融合时进辑传代，传代前将细胞簧37℃艇温水浴瓣床220次，min振摇12h，然后颧去脱落的细胞， 将贴整的纲胞抟代培箨，以丧除星形胶戚细胞莰两豹神经细胞釉其他胶屐细胞。 L2．2显形胶质细胞的鉴定 用免疫细胞化学方法，检测胶质纤维酸性蛋白(glia】_删呵acidicp∞tein，G】融．P)表达荆性细胞， 以捺剐星形腔藏细胞。 l。2．3M玎法梭溺细胞增殖能力 取镟摇纯化腐的星形胶质细胞，O，125％胰酶和O．02％DTA消化细施，以2×l矿个，m：l细施浓度按种予 平行礼。BⅨ嘻缀：每孔加lO肚g矗nl 蕊lPD98059编：每诧加2舢∞鼬LPD98059 5 组翱12pl的篼斑清DM五M摩12螭葬液。继续蛤莽43h藤捡测细胞增魑潘谯。梭测之前簿彳L加入20{I_dmg触l M1T，继续溢肖4h，离心敷戎上清，加入150m，彳LDMsO终止反艨。EⅨ800姆桥仪检测490雠波长处吸 “光值(A德)。率蜜骏煎笈3次。 l。2．4蛋白印逑捡铡EltK的滩性 取第=代细魏，O．125％骧酶和O．02％ED下A消化，绷入墙薄液吹打混匀。援种“=}：培养舨。实验前以无 曲t滴培游基饥饿细胞24 终浓度为100 h盾翩B瑚盯：空囱对照缀： n酌豇k捌)blF溯PD98059组：加M)9∞59懋懋浓度为Ioo|Imo儿，l 绷等爨光j舷漪蟠葬液。37℃、5％002条件F塔荠lh聪提取细脆总摄囱。劂毒玛斯镪蓝G250试剂盒，在 分毙光缆计595脚下梭测样奉的吸光饿(A德)劳诈算撩翻的浓度。每乳加入loopg摄翻进盼SDS．PAGE凝 胶电泳，将靶蛋自从凝腔转移歪硝黢纤维索膜膜(NC)，进行黼誊鳃染色，搬措滠自Maf蛔以确窕转膜教 h，按O．1m№m2膜稠入。抗(1：500)，4℃静麓过夜。