豫医无毛小鼠2细胞胚胎的冷冻研究.pdfVIP

第六届中南地区实验动物科技交流套 论文汇编 豫医无毛小鼠2一细胞胚胎的冷冻研究 杜春燕+，章金涛，薛敬礼，吏崇敏，邢金山，王纯耀，金树兴 (郑州大学实验动物中心，郑州450052) 【摘要】目的探讨豫医无毛小鼠2一细胞胚胎的冷冻与复苏情况。方法用慢 速冷冻、常规建璃化冷冻两种方法对豫医无毛小鼠2-细胞胚胎进行冷冻、复苏，比较 2一细胞胚胎复苏的效果。结果 用程序冷冻法和玻璃化冷冻法冷冻保存的无毛小鼠 2一细胞胚胎，一个月后解冻，胚胎存活率分别为82．1％、79．7％；存活且透明带完好率 分别为73．9％、69．3％，两种方法胚胎的存活率差异不显著(p0．05)。结论玻璃化冷 冻法和程序冷冻法都可用于豫医无毛小鼠2-细胞胚胎的冷冻保种。 【关键词】2一细胞胚胎；玻璃化冷冻；程序冷冻 hairless 豫医无毛小鼠(Yuyi 无毛突变株，其表型与国外报道的无毛小鼠很相似Ⅲ。经实验证实该突变应为常染色体隐性遗传[2-31。 在培育过程中发现，该突变不仅影响小鼠的被皮结构，还影响小鼠的生长发育，无毛雌性小鼠还出现 受孕率低，母性差，不能很好地护理它们的幼仔，幼鼠很难成活。为避免近交衰退、遗传污染、遗传漂 变，防止无毛小鼠的变种或灭绝。为此，我们对雌性豫医无毛小鼠实行超数排卵，对获得的胚胎进行 冷冻、复苏，比较不同条件下无毛小鼠的2一细胞胚胎冷冻、复苏的效果，找出最佳冷冻方法，为该分离 近交系保种、育种、以及在生物医学领域的应用提供理论依据。 1材料与方法 1．1试剂 甲基亚砜、蔗糖(均购白GIBCO公司)。 1．2仪器设备 洗卵管(自制)，生物洁净工作台(BCM一1000型，苏净集团安泰公司制造)、倒置显微镜(日本尼 Biomed (英国，Planer)、Planer LNP4液氮泵、l／4ee麦管(美国)。 82 论文汇编 第六届中南地区实验动物科技交流套 1．3试剂的配制 玻璃化溶液的配制：冷冻渡配方见实验方法 PBS、M2、M16培养液等的配制所需的水均为三蒸水， 1．4实验动物 近交系豫医无毛小鼠，由郑州大学实验动物中心提供，雌鼠为8～1l周龄，雄鼠8～12周龄。 1．5实验方法 1．5．1胚胎的采集 选择动情闻期的无毛雌鼠，于当日(第一天)14：00-15：00每只腹腔注射孕马血清促性腺激素 鼠(雌：雄=1：1)合笼。次日清晨检查阴栓，把有阴栓的雌鼠处死，消毒后在超净工作台上打开腹腔，分 别取出双侧输卵管，放入盛有M2的培养皿中，在体视显微镜下，用M2冲洗输卵管内容物，再加人3eel 透明质酸酶，消融5min，同时用加样器轻微吹打，待胚胎散开后，在M2中洗三次，移入M16培养液中， 上盖优质石蜡油，放到37℃、5％C02培养箱中培养待用…。 。 1．5．2小鼠胚胎的鉴定 1-2细胞期的受精卵被透明带包裹，细胞质均匀，无明显的大颗粒，形状圆而饱满，立体感强。分 裂正常的胚胎，卵裂球大小较为均一、透亮，细胞质均匀，无碎片，卵周隙较小，卵裂球充实，不萎缩， 形状圆而饱满，有强的立体感。在实体显微镜下，收集大小均匀、张力好、无碎片的2一细胞胚胎随机分 为2组，每组150枚。 1．5．3慢速冷冻一快速复温 PROH+ 从_7℃降至一30℃，以-10。12／rain从一30℃降至一1lO℃。将麦管投入液氮罐中，一196‘c下保存。 解冻过程：将麦管从液氮罐中拿出，室温下30s，30℃水浴中30s，37℃条件下，将2一细胞胚胎置入 1．0mol／1 PROH+0．2moUl蔗糖、0．5mol／l PBS中10min，观察存活情况，挑选发育好的胚胎准备移植。 1．5．4常规玻璃化冷冻法 管，并用封口胶封13，胚胎停留在冷冻液2中的时间严格控制在30s(包括装管)，目的是为了减少冷冻 液对胚胎造成的毒性损伤，迅速将