菌种的制备和保藏 1.pptVIP

第五章菌种的制备和保藏 授课教师 贺立虎 典型的生长曲线 （Growth curve） 营养物浓度与对数期生长速率和产量 作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量 生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子 第二节 固体孢子制备 固体孢子是生产种子的一种形式。 抗生素生产中选用哪一种种子形式进罐完全取决于菌种的遗传特性。 一般繁殖能力强，孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。 固体孢子进罐优于菌丝进罐。 因为分生孢子处于半休眠状态，细胞内的代谢活动降到最低点。 进种子罐后，每个个体都从同一水平起步生长繁殖。 因此可以取得同步生长或接近同步生长。后代菌丝繁殖也比较一致。 进罐前的固体孢子如能在水中浸泡数小时，使进罐后有利于孢子发芽，更能取得同步生长的效果。 孢子的扩大繁殖可经过斜面培养基生长或谷物固体培养基生长，需视菌种特性和生产工艺的需要而定。 种子采用固体孢子直接进种子罐的抗生素品种有青霉素、土霉素、四环素、麦迪霉素等。 一、不同菌种的固体孢子制备工艺 以四环素生产菌种的斜面孢子制备为例。 四环类抗生素产生菌的分生孢子繁殖迅速，孢子数量多。 每支茄子瓶斜面的生长周期为3～4d，孢子总数为(50～100)亿以上。 已能满足进罐孢子数的要求。因此采用斜面孢子制成孢子悬液直接进罐的种子工艺。 四环素生产菌种的固体孢子制备工艺如下。 1．斜面培养基(％) 麸皮3.2，(NH4)2HP04 0.015，MgS04 0.005，琼脂2.2，KH2P04 0.0l，装量60mL(每个茄子瓶)。 2．斜面孢子培养 接种斜面后于35℃恒温室培养100h。 培养室内的空气湿度不得低于30％，以保证菌丝和孢子的正常生长。 培养成熟的斜面孢子每瓶加无菌水40～50mL，制成孢子悬液，合并在一个茄瓶中，装上微孔针头压差接种法装置，利用压差将孢子液接种到种子罐内。 接种数量为500亿个孢子／m3种子液。 视斜面孢子量的多少，每罐批接种2～4个茄瓶斜面。 生产备用的斜面孢子冷藏保存，保存期不超过一个月。 二、影响固体孢子质量的因素和控制孢子质量的方法 1．孢子质量的影响因素 孢子质量的影响因素包括原材料质量、培养基配比、培养条件(如温度、湿度、通气量)，还有孢子发育阶段、孢子数量等。 固体孢子的质量控制主要是控制孢子生长在传代的最佳阶段。 传代的最佳阶段也是菌种保藏的最佳阶段。 该段能最大限度地抵御环境的不利因素，使自身的遗传物质少受外界条件的影响。 2．固体孢子培养的最佳阶段 固体孢子的生长繁殖可划分为三个生理阶段，即营养菌丝繁殖，气生菌丝繁殖和分生孢子繁殖。 在孢子繁殖的三个生理阶段中，营养菌丝和气生菌丝属于繁殖体，细胞内含物不稳定，处于不断变动状态，所以该生理阶段不适宜保存和传代。 分生孢子属于遗传体，是相对独立的生理阶段。内含完整的遗传物质。 不同分生孢子间的内含物比较稳定，传代或保存均能保持菌种的基本特性。 一般以分生孢子进行传代和保存。 3.培养基组分 培养基组分是影响孢子量的重要因素之一。 主要是培养基组分中的糖、氮比例和某些无机盐对孢子数量的影响很大。 因此，菌种产孢子数量的多少，一方面与菌种的遗传基因型有关，另一方面则与培养条件有关。 4.通气量的控制 抗生素产生菌都是好氧菌，通气量对其生长繁殖和新陈代谢都有重要作用。 通气不良会影响分生孢子的形成。 在固体孢子的培养中，为求批间、瓶间孢子数量的一致，除了接种量必须均匀外，通气量也必须均匀一致。 故种子培养瓶(试管、茄子瓶、三角瓶等)使用的棉塞应质量一致。使各瓶孢子间通气量一致。 5．培养温度的控制 微生物的生长温度与最适温度是不同的。微生物能够生长的温度范围较宽。 一般在24～37℃多数微生物都能生长。但其最适温度却各不相同。 青霉素产生菌的最适温度为24～36℃。洁霉素产生菌为30℃左右。 最适温度是指细胞新陈代谢活动的适宜温度。 有些微生物菌丝生长的最适温度和生物合成抗生素的最适温度有所差异。 6．培养室湿度的控制 固体孢子培养时要求适宜的空气湿度。 湿度的变动会影响种子间的差异。 湿度大引起菌丝生长旺盛，减弱孢子的生长。 旺盛生长的菌丝产生的强的代谢活动出现大量呼吸水，呼吸水凝成水滴从瓶壁流下，影响气生菌丝和分生孢子的繁殖。 最适宜的空气湿度为60％左右，且要求恒湿。 有实验证明土霉素产生菌培养时相对湿度偏低，结果使孢子数量减少1倍以上 。 血球计数板是一块特制的载玻片，上面