生物化学与分子生物学（南方医科大学）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量.pptVIP

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学示范中心 蛋白质的理化性质 蛋白质的两性电离及等电点； 蛋白质的沉淀； 蛋白质的变性； 蛋白质的胶体性质； 蛋白质的水解； 蛋白质的颜色反应； 电泳技术 电泳：带电粒子在上电场的作用下，向与其电性相反的电极方向移动的现象。 醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素做固体支持物的电泳技术。 醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯等）后，涂抹均匀，干燥后形成的薄膜。该薄膜具有均一的泡沫结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动阻力小。 醋酸纤维素薄膜电泳的优缺点 是近40年来推广的一种经典的技术。 灵敏度高，用样量少（2～3μl） 分离效果好，不吸附蛋白，不吸附染料，无拖尾 快速简便 易保存、易定量 应用广泛：可用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定 缺点：分辨率比聚丙烯酰胺电泳低 实验原理-1 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料-1 样品 健康人血清（新鲜、无溶血） 试剂 1. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L） 2．氨基黑10B染色液 3．漂洗液 4．洗脱液：0.4mol/NaOH溶液 仪器及器材 1．V-1100分光光度计（×1）； 2．恒温水浴箱（×1）； 3．试管（×6）、试管架（×1）； 4．1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）； 5．醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）； 6．培养皿（×5）； 7．点样器或载玻片（×1）； 8．平头镊子（×2）； 9．剪刀（×1）； 10．电泳槽（×1）； 11．直流稳压电泳仪（×1）； 实验流程 点样示意图 电泳槽解剖图 实验结果 电泳结果图 实验结果 光密度计扫描图： 数据记录 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学示范中心 LOGO 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology 实验思路 蛋白质的理化性质有哪些？ 本次实验利用了哪个性质？ 蛋白质的分离方法有哪些？ 本次实验利用了哪种方法？ 该方法怎么样分离？ 学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法。 了解电泳技术的一般原理。 掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 实验目的 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量 占总蛋白的％ 分子量 等电点 血清蛋白质　　　　　　　　　　 12～20 156,000～950,000 6.85～7.3 γ－球蛋白　　 　　　 6.5～12 90,000～150,000　　 5.12 β－球蛋白　　　 　　　 4～9 300,000　 5.06 α2－球蛋白　　　　　　　　　 　　　 2～5 200,000 5.06　 α1－球蛋白　　 　　　 　　　　 57～72 69,000 4.64　 清蛋白　　　　 　　　　　　　　 缓冲液pH=8.6 pI＜pH 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 实验原理-2 血清蛋白依次分为清蛋白， 球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 预测血清蛋白电泳区带图 膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 实验原理-3 实验材料-2 准备 点样 电泳 染色 漂洗 定量 1．准备与点样： 取2×8cm的膜条 充分浸透在巴比妥缓冲液中 滤纸吸去多余的缓冲液 亚光面距一端1.5cm处取一点样线 点样器下端粘上薄层血清 垂　直 点 样 实验步骤-1 取出膜条 8cm 2cm 点样线 点样区 1.5cm (粗面） 点样线尽量点得细窄而均匀 － ＋ 小组标记 样品标记 放　置 膜　条 平衡5 分钟 通 电 关闭 电源 2．电泳 点样面向下 点样端置于阴极 膜条贴