生物化学与分子生物学（南方医科大学）血清清、球蛋白分离（录像） 2.pptVIP

* 生物化学与分子生物学实验教学中心 蛋白质的理化性质包括分子量、溶解度、电荷、特异结合部位及其他性质，不同的理化性质有相对应的纯化方法。根据分子量的大小有～～～～的纯化方法，根据溶解度的大小有～～～～的纯化方法，根据蛋白质所带的电荷量的多少有～～～的纯化方法，根据特异结合部位有～纯化方法，根据其他性质有～～纯化方法。可根据实验要求选用合适的纯化方法，表格中带星号的方法就是我们今天要学习的纯化方法。 * 血清中含有多种主要蛋白质包括：清蛋白和球蛋白，球蛋白又包括为?1、?2、 ?、?-球蛋白。今天的实验是要分离清蛋白和?-球蛋白，我们来看一下他们的等电点及分子量的区别。清蛋白的等电点为4.88， ?-球蛋白的等电点为6.85~7.3。两者的值差距较大，如果把蛋白质放在pH6.5溶液中，清蛋白由于等电点低于pH6.5所以就会解离而带负电荷， 同时?1、?2、?-球蛋白也会解离而带负电。 由于清蛋白的分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。?-球蛋白的等电点高于pH6.5所以解离而带正电荷。本实验就是根据蛋白质的不同等电点不同分子量来进行分离和纯化的。 * * 像筛子一样，但相反的是，大分子先被洗脱，小分子后下来。通过凝胶层析即可将大小不同的蛋白质分离开来。 离子交换层析分为阳离子交换和阴离子交换，阳离子交换即表示离子交换层析柱带负电荷，可吸附带正电荷的蛋白质，带负荷的蛋白质不被吸附直接随洗脱液。阴离子交换表示阴离子交换柱带正电荷，可吸附带负电荷的蛋白质。带正电荷的蛋白质不被吸附直接流出。通过离子交换可分离出电荷性质不同的蛋白质。 带电荷量不同的蛋白质可加大流动相即洗脱液的离子浓度来进行分离。比如，带负电荷的样品全部交换并吸附到带正电荷的阴离子交树脂上，负电荷较少的~~~~~以上都是根据蛋白质电荷性质不同和所带电荷量不同来达到分离纯化蛋白质的目的。 * 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.3 DEAE膜是一种季铵碱 * 1.离心机要在天平上配平。2.先把缓冲液液面降至略高胶床面，确保胶床不暴露于空气中，以免稀释蛋白溶液。3.用滴管吸取沿管壁缓慢加入，避免冲起胶床。4.做好标记，不要混淆清蛋白和球蛋白。5.不要错过蛋白质收集的机会。峰值判断：第二滴沉淀远明显于第一滴时。 * 所有纤维膜完全湿透后才能开电源。 * 染色液回收，漂洗液倒掉。 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 * 内 容 实验目的 1 实验原理 2 实验材料 3 实验过程 4 5 注意事项 * 实验目的 1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5.了解柱层析技术 * 实验流程 盐析法进行粗分离 DEAE纤维素离子交换层析 粗提 脱盐 纯化 醋酸纤维素薄膜电泳 鉴定 葡聚糖凝胶G-25层析 * 实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 * 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 蛋白质的理化性质 常用的纯化方法 分子质量 透析、超滤 凝胶层析★ 离心 溶解度 调整pH 调整离子强度★ 降低介电常数 电荷 电泳★ 等电聚焦 离子交换层析★ 特异结合部位 亲和层析 其他性质 吸附层析 液相层析 气相层析 * 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 相对分子量（×104） 含量（％） 4.88 6.9 57~67 5.06 20 2~5 5.06 30 4~9 5.12 9~15 6.2~12 6.85~7.3 15.6~30 12~20 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A 在pH6.5溶液中，清蛋白解离而带负电荷， 同时?1、?2、?-球蛋白也会解离而带负电。 由于清蛋白的等电点、分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。 ?-球蛋白的等电点高于pH6.5所以解离而带正电荷。 * 实验材料 样品：人混合血清 试剂： 葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱 二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸溶液 1%BaCl2溶液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 氨基黑10B染色液、漂洗液 器材：层析柱、电泳仪、电泳槽等 1. 粗提原理-盐析法 * 盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而 分离出来。 水化膜减弱、