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生物亲和 亲和分离纯化 2011发酵工程 秦涛 定义 原理 应用 一.定义 生物亲和作用：生物分子间的特异性作用，生物分子能在某种情况下（常需要介质）能够识别特定物质并与之吸引结合的一种现象。 二.原理 1.亲合作用结构特点：钥匙和锁孔的关系 pro立体结构中含有某些亲和结合的部位，这些呈凹陷或凸起部位恰好进入或包含与其发生亲合作用的部位。 2.亲和作用力 亲和作用的发生不仅需要锁孔结构，还需要相互作用力。 作用力有以下： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键 3.亲合作用的影响因素 ①离子强度 假如Affinity主要源于静电引力或氢键时，增强Ⅰ就会减弱Affinity，如：许多亲和吸附的目标蛋白质可用于高浓度盐溶液洗脱，说明静电引力占据主要地位；疏水作用则随Ⅰ提高而增大，适合主要是疏水作用力的。 ⑤螯合剂 如果亲和作用主要是亲和分子与金属离子形成的配位键，则加入EDTA等螯合剂可去除金属离子，使亲和消失。 三.亲和作用的应用 亲和层析 膜亲和过滤 亲和双水相分配 1.亲和层析（Affinity Chromatography）是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。 原理 可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。 亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。它们构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 配基是连接载体和被分离分子的桥梁，它有两个基团，一个与载体结合，一个与被分离分子结合。 亲和层析法的基本过程 配基固相化：将与纯化对象有专一结合作用的配基连接在水不溶性载体（凝胶）上，制成亲和吸附剂后装柱。 亲和吸附：将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质被洗涤流出层析柱。 解吸附：用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。例如用甘氨酸－HCl缓冲液或尿素溶液洗脱。 载体的选择原则 用于亲和色谱的理想载体应具有的特性由有： 不溶于水但要有亲水性；疏松网状结构，容许大分子自由通过，即具有渗透性；有一定硬度，最好为均一的珠状；具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；非特异性吸附能力极低；能抗微生物和酶的侵蚀；有较好的化学稳定性。 常见的载体 琼脂糖凝胶：亲水性强，理化性质稳定（商品名：Sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶：理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂，抗微生物能力强，特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。 葡聚糖凝胶：有良好的化学及物理性质，孔径小。 纤维素：非特易吸附严重，廉价，易得。 特点 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但它必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。亲和层析的关键是要保留配基的生物活性。 具体应用 纯化生物大分子，稀溶液的浓缩，不稳定蛋白质的贮藏，从纯化的分子中除去残余的污染物。用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子、分离核酸。 酶：底物、抑制剂、辅酶 抗体：抗原、病毒、细胞 外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、 细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白 激素及维生素：受体、载体蛋白 细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素 谢谢！