酶联、放射免疫测定2011.12.ppt

酶联免疫吸附测定技术(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA）放射免疫测定技术（radioimmunoassay,RIA） 张缨-运动生化教研室 一、概论 （一）标记的免疫技术 免疫技术：抗原抗体反应 标记物：放射性同位素、酶、荧光素 三大标记技术 放射免疫测定、荧光抗体技术、 酶免疫测定 应用：免疫组织化学 免疫测定 （二）ELISA 方法类型 夹心法 间接法 竞争法 E E 终止液 标本 酶标抗体 底物 显色 显色 固相 固相 标本 酶标二抗 底物 1.夹心法 2.间接法 3.竞争法 （基本原理） 非标记抗原Ag（antigen） 标记的相同抗原Ag* 一定量特异性抗体Ab(antibody) Ag ＋ Ab Ag-Ab Ag*＋ Ab Ag*-Ab Y 固相抗体 B/B0=（B-NSB）/（B0-NSB) B：各标准品或样品OD值 B0：浓度为0的标准品的OD值 NSB：空白孔 LogitB/B0=ln（B/B0）/(1-B/B0) 标准品浓度（pg/ml）：S0=0；S1=50；S2=100；S3=250；S4=500；S6=1000 二、发展史 1941年，Coons建立了荧光素标记抗体技术，定位组织和细胞中； 1955年 Berson、Yalow在研究胰岛素时创立放射免疫技术，1977年该技术被授予诺贝尔奖； 缺点：应用放射性同位素，对人体有一定危害 1966年，美国的Nakane和Pierce以及法国的Avrameas和Uriel同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，发展了一种酶标固相免疫测定技术。 酶联和放免测定优点 灵敏度高：10-9－10-12克，毫微克-微微克水平（ng-pg）； 特异性强：抗原-抗体反应； 准确性好：解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题； 操作简便： 三、酶联免疫测定技术 （一）必备试剂 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 酶标记的Ab或Ag----结合物 酶反应的底物-------底物 1.免疫吸附剂 （1）固相载体 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应 ⑵ 常用载体 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板（酶标板） （3）Ag或Ab 纯度高、效价高、结合力高 （4）免疫吸附剂制备(固相Ag或Ab) 包被：将Ag或Ab固相化的过程 如：包被抗体：酶联板每孔加100μL抗体缓冲液，4 ℃ 过夜；甩净。 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰。 2. 酶结合物 （1） 酶的要求 纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 （2） ELISA常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）、?-半乳糖苷酶等 （3）酶的底物 HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm) 四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黄色)，α-萘酚(红色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(红色) 4-氯-1-萘酚(灰蓝色) AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 ?-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-?-半乳糖苷：荧光 （4）酶结合物的制备 A 戊二醛交联法 B 过碘酸盐氧化法 （二）操作标准化 1 加样 2 保温 3 洗涤 4 比色 （三）举例 血清IL-6浓度的测定 1.试剂盒： （1）抗体酶标板1个（96孔可拆） （2）抗原标准品6瓶：标准品浓度（pg/ml）：S0=0；S1=50；S2=100；S3=250；S