上课用第二课时基因工程的基本操作程序1111.ppt

为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。 寻根问底： * 用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同的黏性末端 切口 DNA连接酶 1.过程: 二、构建表达载体 —— 核心 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15） 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 3.基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 调节基 因 操纵基 因 结构基因 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶 酶 RNA聚合酶 启动子 RNA聚合酶 启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？ （1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达； （2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 注意 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 三、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 （一）转化： 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 （1）农杆菌转化法 ①特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 ③转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄蕊 雌蕊 2.将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中） （2）操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 3.将目的基因导入微生物细胞 思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？ 用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性 受体生物 植物 动物 微生物 受体细胞 导入方法 受