脱血红素细胞色素C的跨膜转运与N端序列的两亲性螺旋结构.pdfVIP

维普资讯 脱血红素细胞色素 c的跨膜转运与 N 端序列的两亲性螺旋结构 杨福愉 李南欣 王贤树 (中国科学院生物物理研究所，北京 lO008o) 关键词 脱血红素细胞色素 c、a-螺旋结构、踌膜转运速率 蛋 白质跨膜转运是当前分子生物学、细胞生物学研究中十分活跃的领域之一．在真核细胞 中，蛋白质跨膜转运主要有三种类犁：(1)以胞吞或外排形式通过质膜 (2)跨内质网膜转运 ： (3)跨线垃体、叶绿体等膜系的转运．线粒体的太部分蛋白质是在细胞质虎枝糖体上以前体的 形式合成的，然后定 向运送至线粒体的各个区域并加工成为成熟型蛋 白质．大部分前体与其 成熟形式相比，N端多出一段肤链 ，称为导肤 ．Schatz等认为，导肽形成丽亲性螺旋结构 (amphiphilichelix)对跨膜运送是很重要 的 ． 细胞色素C的前体——脱血红素细胞色素 C(Ap0c”ochr0meC，简称 apocyt．c)也是 在细胞质 中合成 ，然后跨线粒体膜与血红素 (berne)结合形成细胞色素 C，但它没有导肽．B． DeKruijff实验室 已证明 apocyt．c可 自发插入或通过人工膜 ． 我们选择了四种进化程度 不同的细胞色素 c，利用它们N末端氨基酸形成 一螺旋结构的两亲性程度差异 ，研究这一特 性与其跨膜转运速率的相关性． 一 、 材 料 和 方 法 1．材料 四种细胞色素 ：马心、金枪鱼心、鸡心及假丝酵母 (Candidakrusei)均为 Sigma产品．通过硫酸银盐 (AgSO·)法去掉血红素制成 apocyt c ，于 一20~(2保存在含有 0．01％巯基 乙醇的 PIPES缓冲液 5【0mmol／LNacl，10mmol／LPIPES(1，4-piperazine—bis (ethanesulfonicacid))，pH7．0】中．胰蛋 白酶、大豆胰蛋 白酶抑制剂：过硫酸铵 、甲叉丙烯酰 胺系 Sigma产品． 苯 甲酰一L一精氨酸乙酯 (BAEE) 为中国科学院上海生物化学研究所产 品，其他电泳试剂均为国产分析纯。 2．方法 · 。 (1)螺旋轮 (helicalwhee1)排列． 这是根据蛋白质一 级结构预测二级结构 的一 种方 法 ． 参考晶体学研 究及其他分析高级结构的研究结果，我们选择 四种 apocyt．c较有可 能形成 一螺旋的N端肽段 (3一l2位氨基酸残基) ，将它们排列成螺旋轮，比较它们的两亲 性．根据结构预测 ，假丝酵母 N端 “多余的”6个残基不易形成 一螺旋结构，故未进行排列． (2)脂质体的制备． 包有胰蛋 白酶的单层大脂厦体依 Szoka＆-Papahajopoulos的反相 蒸发法制备 ．酶浓度为 2rag／ml的 PIPES缓冲液，用 MSE 超声仪制好 的脂质体用 PIPES 缓冲液透析过夜后，离心 (1lO00r／rnin，O一4℃，30min),沉淀用 PIPES缓冲液洗涤三次 本文 1989年2月 1日啦蓟．1989年 7月 19日收到妊改稿． ’国家 自然科学善盎赞助磺 目． ． 第 秆期 辩 擘 墒 授 维普资讯 以去除脂质体外的酶．之后脂质体悬浮于0．I--05mlPIPES缓冲液中．经测定磷含量爱脂 质体 内容积后，进行转运实验． (3)脂质体内容积 (trappedvolume)的测定． 1)胰蛋 白酶活力测定．BAEE 为底物，浓度 1mmol／L，紫外吸收法铡定酶活． 2)内容积铡定．分别测出酶浓度为 2mg／ml的 PIPES缓冲液、内包胰蛋白酶的脂质体 悬浮液及经 10弗 triton裂解后的酶活力，从而计算出内容积．计算公式为： 内容积 (vl／~otol正磷酸盐 (Pi)) 一 墨 !生!!!型竖昼 堕置 二直鱼堕堡皂堕盟匿亟焦量壁遂