共表达miR398和miR159对拟南芥抗旱性的影响研究.pptVIP

共表达miR398和miR159对拟南芥抗旱性影响的研究 组员：张恒敏 周士博，王靖宜 指导老师：武永军 项目研究内容 本次实验项目初次设计为构建miR398和miR159共表达载体植株，但是在实验过程中，发现miR159过表达植株会出现花粉败育现象，因此，我们改变实验方向，决定构建miR398过表达植株，通过各项抗旱生理指标检测，判断过表达miR398对植物抗旱性的影响。 项目简介：microRNA398 技术路线 项目成果： microRNA前体基因片段的获得 1 M 项目成果：拟南芥过表达载体的获得 项目成果：拟南芥过表达载体的获得 项目成果：表达载体转化农杆菌的结果 M 1 2 项目成果：农杆菌浸花法转化拟南芥后的结果 项目成果：抗性植株的PCR分析 项目成果： T3代种子和植株的表型分析 项目成果：T3代植株生理指标测定 结果分析 miR398b靶向超氧化物歧化酶CSD1和CSD2，导致靶基因的mRNA的剪切，从而抑制基因功能。超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子自由基（O2-）发生歧化反应生成O2和H2O2，生成的H2O2可被过氧化氢酶分解为O2和H2O。而过表达miR398b的T3代植株中，氧自由基含量相对对照组高出12%左右，符合基因的功能。于此同时，变化的幅度相对我们预期变化较小。 结果分析 我们分析的原因可能有以下几种： 其一，植物体内存在Cu-Zn，Mn及Fe三种类型SOD。本实验抑制的CSD属于Cu-Zn-SOD，在植物复杂的基因调控网络中，抑制其中一种基因的表达，可能导致其它同工酶的过表达，从而弥补其功能的缺失。 其二，要考虑野生型各个阶段miR398b的表达量。如果其miR398b本身表达量就比较高，那么过表达它影响可能就不太大。。 结果分析 植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，丙二醛就是膜脂过氧化产物之一。实验显示，转miR398b T3代植株，丙二醛含量升高13%左右，与超氧阴离子自由基O2-变化趋势相同。 在干旱条件下，植物体内脯氨酸含量显著增加，植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性好的品种积累的脯氨酸多。实验发现，T3代植株相对野生型，脯氨酸积累降低了14%左右。 综合形态学观察和抗旱生理指标结果，似乎过表达miR398b不利于植物对干旱胁迫的响应，具体机制还需要进一步深入研究。 致谢 感谢学校的大力支持和资助。 感谢武老师近两年来的辛勤指导。 感谢各位评委老师的耐心聆听和批评指正。 Thanks For Your Attention！ * * MicroRNA（miRNA）是一类非编码、内源性的单链小分子RNA，长度约21～25nt（少数小于20nt的），由一段具有发夹结构的长度为70～80nt的单链RNA前体（pre-miRNA）剪切后生成，植物的前体序列更长。miRNA本身不具有开放阅读框（ORF），不编码蛋白质，成熟miRNA的5’端带有磷酸基团（—HPO4），3’端带有羟基（—OH）。miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性，并且在茎部的保守性更强，但在环部可以存在一些突变位点。包含miRNA的复合体通过与靶mRNA互补识别，引起翻译抑制或mRNA降解来实现转录后基因表达调控。大多数miRNA表现出组织特异性表达和发育阶段特异性表达的特点，这些性质暗示miRNA有可能参与了复杂的基因表达调控的过程,并与生物发育及其行为密切联系。 载体pBI121是一个常用的植物表达载体，CaMV35S启动子驱动的目的基因可以使我们插入的目的基因获得足量表达，同时可以容易改造获得2个甚至更多的35S串联启动子，增大目的基因的表达量。NOS启动子下的新霉素磷酸转移酶基因NPTI为卡那霉素抗性选择标记基因，筛选效果好，减少抗性植株的假阳性。同时具有较多的单酶切位点，易于操作。经pBI121转化的获得的转基因细胞；组织或植株，具有抗卡那霉素的特性。 ＰＣＲ鉴定，结果如图10所示。其中拿到了miR398b的转基因阳性植株。所扩增的片断长度大约为500bp。只有那些确定不疑的条带所代表的株系作为才作为阳性转基因植株。我们共获得个7阳性转基因植株，并将这些植株继续培育，以作后续筛选之用。 MicroRNA（miRNA）是一类非编码、内源性的单链小分子RNA，长度约21～25nt（少数小于20nt的），由一段具有发夹结构的长度为70～80